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May 30, 2023

Antiplasmodiale In-vitro- und In-vivo-Bewertung von Zucker

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12228 (2023) Diesen Artikel zitieren 203 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Arzneimittelresistente Plasmodium falciparum (Pf)-Infektionen sind eine große Belastung für die

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12228 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Infektionen mit arzneimittelresistentem Plasmodium falciparum (Pf) stellen eine große Belastung für die Bevölkerung und das Gesundheitssystem dar. Die Etablierung einer Pf-Resistenz gegen die meisten bestehenden Malariatherapien hat das Problem verkompliziert, und das Auftreten einer Resistenz gegen Artemisinin-Derivate ist noch besorgniserregender. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit wirksamer Malariamedikamente wird es immer schwieriger, Malariapatienten zu heilen. Daher besteht ein dringender Bedarf an wirksameren und erschwinglicheren Behandlungen zur Ausrottung dieser Krankheit. Hierin wurden neue Nukleosid-Analoga, darunter Morpholino-Nukleosid-Hybride und Thio-substituierte Nukleosid-Derivate, hergestellt und auf ihre antiparasitäre In-vitro- und In-vivo-Aktivität untersucht, was zu einigen Erfolgen führte, insbesondere Nukleosid-Thiopyranosid-Konjugate, die gegen Pf3D7- und PfRKL-9-Stämme hochwirksam sind in submikromolarer Konzentration. Ein Adenosin-Derivat und vier Pyrimidin-Nukleosid-Analoga reduzierten die Parasitenlast in Mausmodellen, die mit Plasmodium berghei ANKA infiziert waren, deutlich. Wichtig ist, dass bei den Treffern keine signifikante Hämolyse und Zytotoxizität gegenüber der menschlichen Zelllinie (RAW) beobachtet wurde, was auf ihr Sicherheitsprofil schließen lässt. Vorläufige Untersuchungen deuteten darauf hin, dass diese Thiozucker-Nukleosid-Konjugate zur Beschleunigung der Entwicklung von Antimalariamedikamenten verwendet werden könnten und daher weitere Untersuchungen wert seien.

Malaria ist nach wie vor ein globales Gesundheitsproblem mit 247 Millionen Infektionen und 625.000 Todesfällen weltweit im Jahr 2021, hauptsächlich bei Kindern und schwangeren Frauen1. Die afrikanische Region der WHO ist für einen unverhältnismäßig großen Teil der weltweiten Malariabelastung verantwortlich. Malaria beim Menschen wird durch fünf Arten der von Mücken übertragenen parasitären Protozoen der Gattung Plasmodium verursacht. Die häufigste und tödlichste davon ist Plasmodium falciparum (Pf), die für etwa 90 % der malariabedingten Todesfälle verantwortlich ist2. Trotz verschiedener Versuche zur Bekämpfung und Ausrottung der Malaria ist es den meisten Ländern nicht gelungen, die Krankheit auszurotten3. Arzneimittelresistenz, Toxizität, das Fehlen einer wirksamen Impfung und eine geringe Arzneimittelwirksamkeit sind Faktoren, die dazu beitragen4. Der anhaltende Kampf gegen die Arzneimittelresistenz von Plasmodium erfordert die Erforschung und Entwicklung einer breiten Palette von Therapeutika5. Der derzeit zur Vorbeugung von Pf-Malaria eingesetzte Impfstoff RTS, S/AS016 bietet nur mäßigen Schutz, obwohl eine Pipeline neuer Impfstoffkandidaten optimistisch stimmt. Darüber hinaus ist der wirksame Einsatz der Chemotherapie der ersten Wahl, der Artemisinin-Kombinationstherapie (ACTs), jetzt durch das Auftreten von Resistenzen gefährdet7.

Aufgrund des Fehlens eines Impfstoffs und der wachsenden Resistenzen gegen aktuelle Medikamente ist es äußerst wichtig, neue Antimalariamittel zu entwickeln und insbesondere Medikamentenkandidaten zu entwickeln, deren Struktur und Wirkmechanismus sich von denen aktueller Therapeutika unterscheiden8. Da pathogenen Protozoen die Fähigkeit fehlt, Purine über den De-novo-Weg zu synthetisieren, sind sie für die Entwicklung und Vermehrung auf die Rettung und Wiederverwendung vorgebildeter Purine angewiesen. Sie verfügen über verschiedene Enzyme, die bei Säugetieren nicht vorkommen und als therapeutische Ziele genutzt werden können9. Nukleosid- und Nukleotidanaloga gehören zu den vielversprechendsten Klassen potenzieller Malariamedikamente, da sie als Inhibitoren sowohl im De-novo-Weg für die Pyrimidinnukleotid-Biosynthese als auch im Salvage-Weg für Purinnukleotide von Pf10 wirken können. Acyclonukleoside11 sowie 5'-Thionukleoside12 wurden als wirksame Inhibitoren von Pf beschrieben. Gesättigte sechsgliedrige Stickstoffheterocyclen, einschließlich Morpholin, sind häufige Strukturelemente antiplasmodialer Verbindungen13,14.

Kürzlich haben wir Synthesemethoden für die Herstellung neuer Arten von kohlenhydratmodifizierten Nukleosidanaloga entwickelt, die in zwei Hauptgruppen unterteilt werden können. Die erste Gruppe umfasst Morpholino-Nukleosid-Hybride, die aus Morpholino-Einheiten am 5'-Ende und einem Nukleosid oder 2'-Desoxyribonukleosid am 3'-Ende bestehen15. Die zweite Gruppe besteht aus konfigurationsveränderten, l-lyxo-, d-xylo- oder d-arabino-konfigurierten Nukleosidderivaten, die einen Sulfanylmethyl-verknüpften Substituenten an verschiedenen Positionen des Furanoserings tragen und durch photoinitiierte radikalische Addition verschiedener Thiole an C4‘ hergestellt werden können. , C3'- oder C2'-Exomethylen-Anteil von Nukleosiden16,17,18,19. Angesichts des großen Potenzials von Nukleosidanaloga11,12 sowie morpholinhaltigen Derivaten13,14 in der Malariatherapie haben wir beschlossen, die antiplasmodiale Aktivität der neu entwickelten Arten von Nukleosidanaloga zu testen. Nukleosidtransporter spielen eine Rolle bei der Aufnahme bestimmter Malariamittel, darunter Chloroquin. Diese Transporter erleichtern den Transport von Nukleosiden und nukleosidähnlichen Verbindungen durch die Plasmamembran des Parasiten. Es wurde vermutet, dass Chloroquin über Nukleosidtransporter in mit Plasmodium falciparum infizierte Erythrozyten gelangt, die als Eintrittspunkte für die Verbindung in den Parasiten dienen. Dieser Aufnahmemechanismus ermöglicht es Chloroquin, seinen Zielort zu erreichen und seine Antimalariawirkung auszuüben20.

Zuvor hergestellte Morpholino-Nukleosid-Hybride (Abb. 1)15 wurden in die biologischen Studien einbezogen, und eine neue Bibliothek thiosubstituierter Nukleoside (Abb. 2) wurde ebenfalls erstellt, um die strukturelle Vielfalt von Thiol-Substituenten zu untersuchen und die bioaktiven Komponenten der Gruppe zu finden . In diesem Manuskript stellen wir diese beiden Sätze nukleosidbasierter Hybridmoleküle vor, die eine antiplasmodiale Aktivität besitzen, basierend auf ihrer Bewertung gegen Chloroquin-empfindliche (Pf3D7) und resistente Stämme (PfRKL-9). Die fünf besten Analoga zeigten Hemmkonzentrationen (IC50) im submikromolaren Bereich, die weiter gegen den Chloroquin-resistenten Stamm PfRKL-9 und anschließend in vivo im Mäusemodell getestet wurden.

Morpholino-Nukleosid-Hybride15 (die getroffene Verbindung ist blau hervorgehoben).

l-Lyxo-, d-xylo- und d-arabino-konfigurierte thiosubstituierte Nukleosidanaloga 7–20 und Nukleosid-Referenzverbindungen 21–26 (trefferverbindungen sind blau hervorgehoben).

Die an der Antimalaria-Bewertung beteiligten Morpholino-Nukleosid-Hybride 1–6 sind Oligonukleotid-Analoga, die aus einer oder zwei Morpholino-Einheiten und einem natürlichen Ribo- (1, 2, 4–6) oder 2'-Desoxyribonukleosid (3) bestehen, das über das Stickstoffatom von gebunden ist der Morpholinring (Abb. 1). Diese Hybridderivate wurden aus Nukleosid-2',3'-Dialdehyden in einer doppelten reduktiven Aminierungs-Cyclisierungsreaktion mit 5'-Aminonukleosiden hergestellt15. Die Verbindungen wurden den Malariatests sowohl in geschützter (1–4) als auch in freier Form (5 und 6) unterzogen. Der zweite Satz getesteter Verbindungen umfasst Nukleosidanaloga, die von Adenosin (7–9), Uridin (10–17 und 20) und 5-Methyluridin (18 und 19) abgeleitet sind und einen Thioether-gebundenen Substituenten an der 5-', 3'-Position tragen. - oder 2'-Position der Furanoseeinheit (Abb. 2). Eine Besonderheit der Thio-substituierten Nukleosid-Analoga 7–20 besteht darin, dass sie anstelle natürlicher d-Ribose eine konfigurativ veränderte Furanose-Einheit enthalten. Mit unserer kürzlich etablierten photoinduzierten Thiol-En-Kupplungsmethode21 konnten die mit l-Lyxo (7–9), d-Xylo (10–19) und d-Arabino (20) konfigurierten Nukleosidanaloga mit hoher Stereoselektivität durch radikalisch vermittelte Addition erhalten werden Reaktionen zwischen C4'-, C3'- oder C2'-Exomethylennukleosiden und verschiedenen Thiolen, einschließlich Aminosäurederivaten, 1-Thiozuckern oder Alkylmercaptanen16,17,18,19. Zusätzlich zu den Furanose-modifizierten Nukleosid-Analoga 7–20 wurden einige einfache, geschützte oder teilweise geschützte Nukleosid-Derivate 21–26 als Referenzverbindungen in die Antimalaria-Studien einbezogen. Über die Herstellung von 10,16 1918 und 21–2615,17 wurde bereits berichtet, die Synthese von 7–9, 11–18 und 20 ist in Abb. 3 und Tabelle 1 dargestellt.

Thio-Click-basierte Synthese von 5'- und 2'-modifizierten Nukleosidanaloga.

Zunächst wurde das von Adenosin abgeleitete Nukleosidanalogon 7 hergestellt, indem das 1-Thioglucose-Derivat 27a mit dem 4'-Exomethylenadenosin-Derivat 2817 unter zuvor optimierten Thiol-En-Kupplungsbedingungen unter Verwendung des Photoinitiators 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon (DPAP) umgesetzt wurde. und Bestrahlung mit UVA-Licht (λmax = 365 nm) (Abb. 3). Die photoinitiierte Thiol-En-Reaktion beginnt mit der Erzeugung eines Thiylradikals aus dem Thiol durch Lichtbestrahlung in Gegenwart des Initiators und erfolgt dann über einen Kettenmechanismus für freie Radikale, der einen Ausbreitungsschritt und einen Kettenübertragungsschritt umfasst ein Thioetherprodukt vom Anti-Markownikow-Typ mit voller Regioselektivität21,22. Wir verwendeten mehrere kurze Bestrahlungszyklen und fügten der Reaktionsmischung immer eine neue Dosis Initiator hinzu, da sich dies als wirksamer als eine längerfristige kontinuierliche Bestrahlung erwiesen hat16,22. Dementsprechend wurden Alken 28 und Thiol 27a durch UV-Bestrahlung für 4 × 15 Minuten in Gegenwart von 4 × 0,1 Äquiv. von DPAP. Die Additionsreaktion bei −80 °C ergab das Thioglucose-Nukleosid-Konjugat 7 als 3:1-Mischung der l-Lyxo- und d-Ribo-Diastereoisomere. Nach der chromatographischen Reinigung wurde eine 6:1-Mischung erhalten, die stark an dem l-Lyxofuranosyl-Hauptprodukt angereichert war (die Isomerenreinheit von 7 betrug 86 %).

Wir haben die Schutzgruppen von 7 entfernt, um ihre Rolle bei der Antimalariaaktivität zu untersuchen. Die Deacetylierung unter Zemplén-Bedingungen ergab 8, während die gleichzeitige Entschützung der Isopropyliden- und Triphenylmethylgruppen mit 90 % wässriger TFA in Gegenwart von Et3SiH Verbindung 9 lieferte.

Um ein 2'-modifiziertes Nukleosidanalogon für den Antimalariatest herzustellen, wurde das 2'-C-Exomethylen-3',5'-O-silylenacetal-Derivat von Uridin (29) hergestellt und einer photoinduzierten Hydrothiolierungsreaktion mit Butyl unterzogen Mercaptan 27b19. Die Reaktion verlief mit guter Ausbeute und nahezu vollständiger Stereoselektivität und lieferte das erwartete d-Arabino-konfigurierte 2'-C-Butylsulfanylmethylnukleosid 20 mit 69 % Ausbeute und einer Isomerenreinheit von 91 % (20:1 d-Arabino:d-Ribo-Verhältnis von 20). ).

Als nächstes stellten wir eine kleine Bibliothek von C3'-substituierten d-xylo-konfigurierten Nukleosidanaloga durch Addition der Thiole 27c-27f an 3'-C-Exomethylen-2',5'-di-O-tert-butyldimethylsilyluridin 30 und her -Ribothymidin 31 (Tabelle 1). Zu den verwendeten Thiolen gehörten 2-Mercaptomethylnaphthalin 27c, L-Cystein-Derivat 27d, Mesna 27e und O-acetylierte 1-Thiohexopyranosen 27f-27i. Die Reaktionen wurden in verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt, die auf der Grundlage der Löslichkeit der Reaktanten ausgewählt wurden, und es wurde Kühlung eingesetzt, um eine hohe Diastereoselektivität zu erreichen. Basierend auf unseren vorherigen Ergebnissen wurden die Thiol-En-Kupplungen bei niedriger Temperatur (– 40/– 80 °C) durchgeführt, um einen hohen Umsatz und eine hohe Stereoselektivität zu erreichen16,17,18,19,21. Unter solchen Bedingungen wurden die hydrothiolierten Produkte (11–18) mit der erwarteten d-Xylo-Konfiguration tatsächlich effizient und mit hervorragenden Diastereomerenüberschüssen erhalten.

Zunächst wurde ein zellbasierter Assay durchgeführt, um die Hemmwirkung aller 26 Verbindungen (1–26) bei Konzentrationen von 1 µM und 10 µM auf die asynchrone Kultur des Chloroquin-empfindlichen Stamms Pf3D7 zu bewerten. Das Wachstum eines intraerythrozytären Pf-Zyklus wurde nach Behandlung mit Verbindungen überwacht, während unbehandelte Parasiten als Kontrolle betrachtet wurden. Bei einer Konzentration von 10 µM hemmte der Großteil der Moleküle mehr als 50 % der Parasiten (Abb. S1). Bei fünf der 26 Verbindungen, dem Morpholino-Nukleosid-Hybrid 1 und den thiosubstituierten Nukleosid-Analoga 7, 16, 17 und 18, wurde beobachtet, dass sie in dosisabhängiger Weise eine signifikante Wachstumshemmung gegen Pf3D7 aufwiesen. Die Morpholino-Nukleosid-Hybride 3 und 5 zeigten ebenfalls eine bemerkenswerte Aktivität gegen Pf3D7, hatten jedoch zytotoxische Eigenschaften (siehe unten). Andere Verbindungen, mit Ausnahme der oben genannten sieben Derivate, zeigten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle gegen den Pf-Stamm 3D7 eine unbedeutende prozentuale Wachstumshemmung.

Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) der fünf Treffermoleküle (1, 7, 16–18) wurde gegen Pf3D7 und den Chloroquin-resistenten Stamm PfRKL-9 gemessen (Abb. 4). In diesem Test wurden synchronisierte späte Trophozoitenparasiten mit unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen behandelt23. Die prozentuale Wachstumshemmung der Parasiten wurde mit dem SYBR-Green-Assay bewertet. Die IC50-Werte der Verbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 gegen Pf3D7 betrugen 0,92 ± 1,8 µM, 1,78 ± 1,3 µM, 1,33 ± 1,07 µM, 1,15 ± 1,5 µM bzw. 1,31 ± 1,1 µM. Als nächstes wurden alle fünf Verbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 gegen den resistenten Stamm PfRKL-9 bewertet und zeigten IC50-Werte von 2,1 ± 1,3 µM, 9,55 ± 1,7 µM, 1,84 ± 1,06 µM, 2,21 ± 1,3 µM und 1,83 ± 0,7 µM , jeweils. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 und Tabelle 2 dargestellt. Die IC50-Werte von Chloroquin gegen Pf3D7 und PfRKL-9 betrugen 25 nM bzw. 125 nM. Obwohl die Verbindungen 3 und 5 eine bemerkenswerte Wachstumshemmung mit IC50-Werten von 1,19 ± 1,1 µM und 1,34 ± 2,1 µM gegenüber Pf3D7 zeigten; und 4,5 ± 2,5 µM und 6,23 ± 1,5 µM gegen PfRKL-9 (Abb. S2), aber sie zeigten Zytotoxizität gegenüber menschlichen Erythrozyten (Abb. S3). Aufgrund ihrer zytotoxischen Natur wurden diese Verbindungen für weitere Experimente nicht berücksichtigt.

Schätzung der In-vitro-Wachstumshemmung und der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) der Trefferverbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 gegen die Stämme Pf 3D7 und Pf RKL-9 (A–E). Zur Berechnung der IC50-Werte wurde die Software Graph Pad Prism 9 verwendet. Diagramm, das die prozentuale Hemmung für dieselbe Verbindung zeigt. Das Experiment wurde dreifach durchgeführt und die Daten wurden als Mittelwerte ± SD ausgedrückt.

Die In-vitro-Bewertung der Verbindungen 1–26 gegen den Chloroquin-empfindlichen Pf3D7-Stamm (Abb. S1) ermöglicht eine vorläufige Analyse der Struktur-Antimalaria-Aktivitätsbeziehungen der beiden neuen Nukleosid-Chemotypen, Morpholino-Nukleosid-Hybride (1–6) und thiosubstituierte Nukleosidanaloga (7–20).

Fünf der sechs getesteten Morpholino-Nukleosid-Hybride zeigten bei einer Konzentration von 1 μM eine bemerkenswerte Hemmwirkung von ~ 50 % gegen den Pf3D7-Stamm (Verbindungen 1–5, Abb. S1A), was das hohe Antimalariapotenzial dieser Strukturen eindeutig beweist.

Unter den konfigurationsveränderten, thiosubstituierten Analoga zeigten die Thiozucker-haltigen Derivate eine hervorragende Aktivität gegen Pf (Abb. S1). Die Konfiguration des Thiozuckers beeinflusste die Antimalariaaktivität in gewissem Maße. Verbindungen mit gluco- und galactokonfigurierten Substituenten (7, 16–18) zeigten eine ausgezeichnete Wirkung, während das Mannopyranosid-Konjugat 15 eine moderatere wachstumshemmende Wirkung zeigte. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass selbst das Mannopyranosid-haltige Nukleosid 15 eine stärkere Hemmwirkung zeigte (~ 50 % Hemmung bei 1 μM Konzentration) als die Alkylthio-substituierten Verbindungen 10, 11 und 19 (~ 5–25 % Hemmung bei 1 μM). μM), was darauf hindeutet, dass die Thiopyranosid-Nukleosid-Konjugate ein erhebliches Antimalariapotenzial haben können. Wir haben herausgefunden, dass der Ort der Substitution keinen Einfluss auf die Antimalariaaktivität hatte. Die Einführung eines geeigneten Thiozuckers entweder in der 5'- (7) oder 3'-Position (16–18) führte zu hochaktiven Derivaten.

Unsere Studie mit den Verbindungen 7–9 legt nahe, dass eine angemessene Lipophilie für die Aktivität thiosubstituierter Nukleosidanaloga entscheidend ist. Während die Deacetylierung (7 → 8) die Antimalariaaktivität nicht wesentlich beeinflusste, führte die Entfernung der lipophilen Tritylgruppen (7 → 9) zu einer signifikanten Verringerung der wachstumshemmenden Wirkung (Abb. S1A). Für die 1-Thiozucker enthaltenden Hit-Verbindungen beträgt der Lipophiliewert clogP ~ 5 (Tabelle 2).

Die Antimalariawirkung von Purinnukleosidanaloga, die auf der Hemmung des Purinstoffwechselwegs beruht, ist gut dokumentiert10,11,12, für Antimalariamittel vom Pyrimidintyp gibt es in der Literatur jedoch kaum Ergebnisse24. In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, dass unter den in dieser Studie getesteten neuen Derivaten mehrere Pyrimidin-Nukleosid-Analoga (1, 3 und 4 aus den Morpholino-Nukleosid-Hybriden und 12, 15–18 und 20 aus dem Thiozucker-Nukleosid-Chemotyp) gute Ergebnisse zeigten /hervorragende Hemmwirkung gegen Pf.

Die Wirkung von Verbindungen auf menschliche Erythrozyten wurde mithilfe der Spektrophotometrie überprüft, indem die Lyse menschlicher roter Blutkörperchen (hRBCs) gemessen wurde. Die Verbindungen wurden bei Konzentrationen von 0,5, 1, 5, 10 und 20 μM mit 10 % (v/v) Erythrozyten-Suspension 1 Stunde lang getestet und der Prozentsatz der Erythrozyten-Lyse durch die Verbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 beobachtet.

Bei einer Konzentration von 20 µM wurde keine signifikante Lyse der Erythrozyten beobachtet (Abb. 5A), während die Verbindungen 3 und 5 Toxizität zeigten (Abb. S3). Um die toxischen Wirkungen der wirksamen Verbindungen auf menschliche RAW-Zellen zu bewerten, wurde ein MTT-Assay durchgeführt und für die Verbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 bis zu einer Konzentration von 500 µM wurde kein offensichtlicher toxischer Effekt beobachtet (Abb. 5B). Tabelle 2 fasst die In-vitro-Bioassay-Ergebnisse und ClogP-Werte der Trefferverbindungen und der Referenzverbindung Chloroquin zusammen.

(A) Wirkung der Verbindungen (7, 16, 17, 18 und 1) auf menschliche Erythrozyten. Die Wirkung der Verbindungen auf menschliche Erythrozyten wurde bei Konzentrationen von 0,5, 1, 5, 10 und 20 µM überprüft. Die bei 415 nm gemessene Absorption zeigte keine signifikante Lyse bei Behandlung mit Verbindungen bis zu 20 µM. (B) Abschätzung der In-vitro-Zytotoxizitätswirkung ausgewählter Analoga gegen embryonale Nierenzelllinien (HEK-293) bei 100 µM und 500 µM.

Das Mitochondrienmembranpotential ist ein Marker für den Funktionsstatus der Mitochondrien. Eine Veränderung des mitochondrialen Membranpotentials, die zu einer mitochondrialen Dysfunktion führt, löst den Zelltod aus25,26. Mitochondriale Dysfunktion wurde mithilfe des membrandurchdringenden JC-1-Farbstoffs nachgewiesen. JC-1 ist eine kationische Sonde. Aufgrund der elektronegativen Umgebung innerhalb der funktionell aktiven Mitochondrien mit hohem Δψm aggregiert es in energetisierten Mitochondrien und ergibt eine rote Fluoreszenz bei 590 nm, bei niedrigem Δψm (depolarisierter Zustand) bleibt JC-1 jedoch erhalten in Monomerform und ergibt eine grüne Fluoreszenz bei 530–10 nm. Ein verringertes Verhältnis der roten/grünen Fluoreszenzintensität der mit Verbindung behandelten Probe im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle weist auf eine depolarisierte Mitochondrienmembran27,28 hin. Die Schädigung der Mitochondrien des Parasiten nach der Behandlung mit den Verbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 wurde gemäß der zuvor beschriebenen Methode gemessen28. Aufgrund der lipophilen Natur von JC-1 ist es zelldurchlässig und sendet ein grünes Signal (525 nm) im Zytoplasma aus, aber das hohe Transmembranpotential funktioneller Mitochondrien führt dazu, dass es aggregiert und ein rotes Signal (590 nm) aussendet. Im Gegensatz dazu zeigte der mit den Verbindungen behandelte Parasit, wie in Abb. 6 dargestellt, eine erhebliche Abnahme der JC-1-Rotfärbung und einen Anstieg der diffusen grünen mitochondrialen Fluoreszenz. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials wurde durch einen signifikanten Rückgang des Rot/Grün-Verhältnisses der JC-1-gefärbten Zählungen bei mit Verbindungen behandelten Parasiten nachgewiesen. Die mit IC50-Konzentrationen der Verbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 behandelten Parasiten zeigten ein verringertes Rot/Grün-Verhältnis von 5,26 ± 1,13, 4,98 ± 1,77, 6,28 ± 1,55, 5,53 ± 1,40 und 5,69 ± 0,70. Der unbehandelte Kontrollparasit zeigte ein Rot/Grün-Verhältnis von 7,04 ± 1,30 (Abb. 6A und B).

(A) Fluoreszenzbilder von Parasiten, die monomeres JC-1 (grün) im Zytoplasma und JC-1-Aggregate (rot) in Mitochondrien zeigen. Die erste Reihe (Kontrolle) zeigt unbehandelte Parasiten mit einem leuchtend roten Signal bei 590 nm, was auf ein funktionierendes Mitochondrium hinweist. Nachfolgende Reihen zeigen die Effekte der 7, 16, 17, 18 und 1 mit hellgrünen und schwach roten Signalen. (B) Das fluorometrische Verhältnis von JC-1 (Aggregate)/JC-1 (Monomer) in der Parasitenpopulation nach Behandlung mit 7, 16, 17, 18 und 1 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die ausgedrückten Daten sind Mittelwerte ± SD. **P < 0,01 vs. Kontrolle: Dunnett-Test. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die wirksamste Verbindung, das 1-Thioglucose-Adenosin-Konjugat 7 mit einem Reinheitsgrad von > 95 % (Abb. S4), wurde im Mäusemodell auf antiplasmodiale Aktivität untersucht. Die antiplasmodiale Wirksamkeit von 7 in vivo wurde in einem mit P. berghei ANKA infizierten BALB/c-Mäusemodell bewertet. Die zusammengesetzte Dosis wurde sieben Tage hintereinander intraperitoneal injiziert. Um die Parasitämie zu überprüfen, wurden an bis zu sieben aufeinanderfolgenden Tagen dünne Blutausstriche von mit P. berghei ANKA infizierten Mäusen angefertigt. Bei einer Dosis von 50 mg/kg zeigte Verbindung 7 eine 60-prozentige Hemmung gegen den Nagetier-infizierenden P. berghei ANKA. Es wurde beobachtet, dass der Prozentsatz der Parasitämie der mit 7 behandelten Mäusegruppe 10 % betrug, verglichen mit der Kontrolle, bei der der Prozentsatz der Parasitämie am siebten Tag 25 % betrug (Abb. 7A). Verbindung 7 konnte die Parasitenlast im Vergleich zu einer Kontrollgruppe unbehandelter Mäuse sieben aufeinanderfolgende Tage nach der Infektion wirksam reduzieren.

Wirksamkeit von Verbindung 7 bei mit P. berghei ANKA infizierten Balb/c-Mäusen. Als Kontrolle dienten unbehandelte Mäuse. Infizierten Mäusen wurden an sieben aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal 7 (50 mg/kg Körpergewicht; n = 5) verabreicht. (A) Der Prozentsatz der Parasitämie wurde anhand von Giemsa-gefärbten dünnen Blutausstrichen vom ersten bis zum siebten Tag nach der Infektion berechnet. (B). Das Überleben der Mäuse wurde 21 Tage nach der Infektion mithilfe der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse beobachtet und statistische Unterschiede im Überleben der Tiere wurden mithilfe eines Log-Rank-Tests analysiert.

Gruppen von Mäusen wurden hinsichtlich ihrer mittleren Überlebensraten 21 Tage nach der Infektion beobachtet. Die mittlere Überlebenszeit (MST) wurde berechnet, die eine Verbesserung der mittleren Überlebenszeit von Mäusen zeigte, die mit 50 mg/kg 7 behandelt wurden (MST = 14 Tage) im Vergleich zur Kontrolle (MST = 10 Tage). Dies weist darauf hin, dass Verbindung 7 in vivo bei einer Dosis von 50 mg/kg eine starke antiplasmodiale Aktivität gegen P. berghei ANKA zeigte und das Überleben der Mäuse im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich verlängerte (Abb. 7B). Um relevante Schlussfolgerungen zu ziehen, wurden statistische Analysen der In-vivo-Daten mithilfe von Graphpad Prism-Datenblättern durchgeführt.

Arzneimittelresistente Malaria hat sich zu einer ernsthaften Bedrohung für die weltweite Malariabekämpfung entwickelt und erfordert die Entwicklung neuartiger Malariamittel, die sowohl gegen arzneimittelempfindliche als auch gegen arzneimittelresistente Malaria wirksam sind. Hybridmoleküle, die neue Einheiten mit unterschiedlichen Pharmakophoren nutzen, stellen einen rationalen Ansatz bei der Entwicklung neuartiger Therapeutika dar. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Nukleosid-1-Thiozucker-Hybride als synthetische Produkte ohne Zytotoxizität geeignete Kandidaten für die Entwicklung von Antimalariamitteln gegen Pf sein könnten. Die IC50-Konzentrationen der oben genannten Nukleosidanaloga wurden an den Stämmen Pf 3D7 und PfRKL-9 bestimmt und lagen zwischen 0,95 µM und 2,21 µM. Diese Analoga führten bei Anwendung in IC50-Konzentrationen zu einer Depolarisierung des Membranpotentials der behandelten Malariaparasiten, was zum Zelltod führte. Eine 50-mg/kg-Dosis der Hit-Verbindung 7, die Mäusen verabreicht wurde, die mit dem Nagetierparasiten P. berghei ANKA infiziert waren, zeigte eine bis zu 60-prozentige Verringerung der Parasitenlast und verlängerte das Überleben der Mäuse.

Zusätzlich zu 1-Thiozucker-Nukleosid-Konjugaten identifizierte unsere Studie auch Morpholino-Nukleosid-Hybride als einen neuen Chemotyp von Antimalaria-Medikamentenkandidaten. Leider ging bei den untersuchten Morpholino-Nukleosid-Hybriden die starke Antimalariawirkung in der Regel mit einer erheblichen Zytotoxizität einher, weshalb für diesen Chemotyp eine weitere Optimierung erforderlich ist, um wirksame und sichere Antimalaria-Leitverbindungen zu entwickeln.

Nukleosidderivate 1–617, 1016 und 1918, Naphtylmethylmercaptan 27c29, Fmoc-Cysteinderivat 27d17, 1-Thiozucker 27f-i30, Adenosin-4'-exomethylen 2816, Uridin-2'-exomethylen 2931, Uridin-3'-exomethylen 3016 und 5-Methyluridin-3'-exomethylen 3116 wurde gemäß Literaturverfahren hergestellt. 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon (DPAP), n-Butylmercaptan 27b und MesNa 27e wurden von Sigma-Aldrich Chemical Co. gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. Optische Drehungen wurden mit einem automatischen Polarimeter Perkin-Elmer 241 bei 20 °C gemessen. Die Reaktionen wurden durch TLC (Kieselgel 60 F254, Merck) mit Detektion durch UV-Licht (254 nm) und Eintauchen in schwefelsaure Ammoniummolybdatlösung oder 5 % ethanolische Schwefelsäure und anschließendes Erhitzen überwacht. Die Reinigungen wurden an Kieselgel 60 (Merck, 0,040–0,063 mm) durchgeführt. Die 1H-NMR- (360 und 400 MHz) und 13C-NMR-Spektren (90 und 100 MHz) wurden mit den Spektrometern Bruker DRX-360 und Bruker DRX-400 bei 25 °C aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen beziehen sich auf Me4Si (0,00 ppm für 1H) und auf die Restlösungsmittelsignale (CDCl3: 77,2, DMSO-d6: 39,5, CD3OD: 49,0 für 13C). Zweidimensionale COSY- und 1H-13C-HSQC-Experimente wurden verwendet, um NMR-Zuordnungen zu unterstützen16. Das Diastereomerenverhältnis der neuen Verbindungen wurde auf der Grundlage ihrer 1H-NMR-Spektren wie zuvor beschrieben18,19 bestimmt. MALDI-TOF-MS-Messungen wurden mit einem Bruker Autoflex Speed-Massenspektrometer durchgeführt, das mit einem Flugzeit-Massenanalysator (TOF) ausgestattet war. In allen Fällen wurden 19 kV (Ionenquellenspannung 1) und 16,65 kV (Ionenquellenspannung 2) verwendet. Für den Reflektronmodus wurden 21 kV und 9,55 kV als Reflektorspannung 1 bzw. Reflektorspannung 2 angelegt. Zur Erzeugung der Laserdesorption wurde ein Festphasenlaser (355 nm, ≥ 100 μJ/Impuls) eingesetzt, der bei 500 Hz arbeitete, und es wurden 3000 Schüsse summiert. 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) wurde als Matrix und F3CCOONa als Kationisierungsmittel in DMF verwendet. ESI-QTOF-MS-Messungen wurden auf einem maXis II UHR ESI-QTOF-MS-Gerät (Bruker) im positiven Ionisationsmodus32 durchgeführt. Für die Elektrospray-Ionenquelle wurden folgende Parameter angewendet: Kapillarspannung: 3,5 kV; Endplattenversatz: 500 V; Verneblerdruck: 0,8 bar; Trockengastemperatur: 200 °C und Trockengasdurchfluss: 4,5 l/min. Für jedes Spektrum wurde eine konstante Hintergrundkorrektur angewendet; Der Hintergrund wurde vor jeder Probe durch Injektion der leeren Probenmatrix (Lösungsmittel) aufgezeichnet. Nach jeder Probe wurde Na-Formiat-Kalibriermittel injiziert, was eine interne Kalibrierung während der Datenauswertung ermöglichte. Massenspektren wurden mit otofControl Version 4.1 (Build: 3.5, Bruker) aufgezeichnet und mit Compass DataAnalysis Version 4.4 (Build: 200.55.2969) verarbeitet.

Die photoinitiierten Reaktionen wurden in einem Borosilikatgefäß durch Bestrahlung mit einer Niederdruck-Hg-Lampe (Osram Supratec UV, HTC 150–211, 150 W, 230 V, R7s) durchgeführt, was eine maximale Emission bei 365 nm ergab, ohne dass eine Vorsichtsmaßnahme auszuschließen wäre Luft oder Feuchtigkeit16. Der Versuchsaufbau besteht aus dem Reaktionsgefäß und dem Kühlmedium (Aceton-Flüssigstickstoff-Gemisch) in einem Dewar-Gefäß und einer UV-Lampe. Vor der Bestrahlung wird der gesamte Aufbau mit einem Aluminiumfolienzelt abgedeckt, um das Laborpersonal vor UV-Licht zu schützen16,30. Die Reinheit der Trefferverbindungen wurde mit einem HPLC-System (Gilson, USA) mit einer Analysesäule (C18) und einem mit Software gekoppelten Thermo Separation Spectra SERIES UV100-Detektor bewertet. Die mobile Phase für die Analyse wurde aus Acetonitril und Wasser (v/v) hergestellt und die Verbindungen zeigten eine Reinheit von > 95 %.

Die Studie wurde entsprechend den einschlägigen Richtlinien durchgeführt. Mäusebasierte In-vivo-Experimente werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) gemeldet.

Das entsprechende Alken, Thiol und DPAP (0,1 Äquivalente/Alken) wurden in dem angegebenen Lösungsmittel gelöst, um eine Lösung mit einem Konzentrationsbereich von 0,2–0,5 M für das Alken zu erhalten (die Lösung sollte so konzentriert wie möglich sein). Die Reaktionsmischung wurde auf die angegebene Temperatur abgekühlt und 15 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt. Nach der Bestrahlung weitere 0,1 Äquiv. DPAP wurde zugegeben und die Bestrahlung weitere 15 Minuten fortgesetzt. Die Zugabe von 0,1 Äquiv. von DPAP und die Bestrahlung wurde noch zweimal wiederholt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft und das Rohprodukt durch Flash-Säulenchromatographie gereinigt.

Verbindung 28 (200 mg, 0,376 mmol), 1-Thioglucoseperacetat 27a (160 mg, 0,452 mmol, 1,2 Äquiv.) und DPAP (9,6 mg, 0,0376 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in Toluol (2 ml) gelöst und zur Reaktion gebracht bei − 80 °C nach der allgemeinen Methode. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie (Gradientenelution Hexan/Aceton 85/15 → 8/2 → 6/4) gereinigt, um eine untrennbare 3:1-Mischung aus 1-[2',3'-O-Isopropyliden-5 zu ergeben '-S-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-d-glucopyranosyl)-5'-thio-α-l-lyxofuranosyl]-N-trityl-adenin (7) und seine 4' -Epimer 2',3'-O-isopropyliden-5'-S-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-d-glucopyranosyl)-5'-thioadenosin (213 mg, 64 %, ~ 3:1-Mischung aus l-Lyxo:D-Ribo-Isomeren) als amorpher Feststoff. Nach einer zweiten chromatographischen Reinigung wurde die diastereomere Reinheit von 7 auf l-lyxo:d-ribo 6:1 erhöht. Rf = 0,08 (Hexan:Aceton 8:2), 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7,98, 7,83 (2xs, 2 × 1H, H-2, H-8), 7,34 (d, J = 7,1 Hz, 8H, aromatisch), 7,29–7,19 (m, 13H, aromatisch), 6,98 (s, 1H, NH), 5,98 (s, 1H, H-1'), 5,48 (d, J = 5,9 Hz, 1H) , 5,21 (dd, J = 6,2, 3,1 Hz, 2H), 5,08 (td, J = 9,7, 4,0 Hz, 3H), 4,64–4,56 (m, 2H), 4,21 (m, 1H), 4,14 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 4,09 (dt, J = 12,4, 3,0 Hz, 2H), 3,65 (ddd, J = 10,0, 4,3, 2,2 Hz, 2H), 3,15 (dd, J = 13,7, 7,6 Hz, 1H) , 2,88 (dd, J = 13,7, 6,1 Hz, 1H), 2,05 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,57 (s, 3H, i-Propyliden CH3), 1,41 (s, 3H, i-Propyliden CH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 170,5, 170,2, 169,4, 169,3 (4C, 4 × AcCO), 154,2 (1C, Cq Adenin), 152,4 (2C, 2 × Adenin CH) 148,3, 144,9 (3C, 3 × aromatisches Cq), 129,0, 127,9, 127,0 (15C, 15 × aromatisches CH), 121,3 (1C, Cq Adenin), 113,4 (1C, i-Propyliden Cq), 90,2, 85,0, 84,1, 83,6, 81,3, 76,0, 74,0, 69,9, 68,2 (9C, Skelettkohlenstoffe), 71,4 (1C, N-TrtCq), 61,9 (1C, C-6''), 28,3 (1C, C-5'), 26,4, 25,1 (2C, 2 × i-Propyliden CH3), 20,7, 20,6 (4C, 4 × AcCH3). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C46H49N5NaO12S+ [M + Na]+ 918,299, gefunden 918,297.

Verbindung 7 (150 mg, 0,166 mmol) wurde in trockenem MeOH (2,5 ml) gelöst, dann wurde der pH-Wert der Lösung auf etwa 10 eingestellt und über Nacht gerührt. Am nächsten Tag wurde die Reaktionsmischung mit Amberlite IR-120 (H+) neutralisiert, filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (CHCl3/MeOH 95/5 → 9/1) gereinigt, um Verbindung 8 (119 mg, 98 %, L-lyxo D-ribo-Verhältnis ~ 3:1) als weißen Feststoff zu ergeben. Rf = 0,36 (CH2Cl2/MeOH 9/1). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7,96 (s, 2H, H-2, H-8), 7,32 (d, J = 7,6 Hz, 8H, aromatisch), 7,16 (dt, J = 22,4, 7,2 Hz, 14H, aromatisch), 5,99 (s, 1H, H-1'), 5,55 (br. s, 1H, OH), 5,37 (d, J = 5,6 Hz, 1H, H-2'), 5,11–5,08 (m, 1H, H-3'), 4,52 (s, 1H), 4,33 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 3,69–3,54 (m, 3H), 3,53–3,47 (m, 1H), 3,44– 3,34 (m, 1H), 3,23 (s, 2H), 3,20–3,03 (m, 2H), 3,02–2,84 (m, 2H), 1,26 (s, 6H, 2 × i-Propyliden CH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 154,1, 148,4 (2C, 2 × Adenin Cq), 144,9 (3C, 3 × aromatisches Cq), 129,1, 128,0, 127,0 (15C, aromatisch), 120,8 (1C, Adenin Cq), 113,4 (1C, i-Propyliden Cq), 90,0, 86,6, 85,0, 83,6, 81,1, 79,8, 77,9, 72,7, 69,3 (9C, Gerüstkohlenstoffe), 71,5 (1C, Trt-Cq), 61,4 (1C, C-6''), 29,2 (1C, C-5'), 26,3, 25,0 (2C, 2 × i-Propyliden CH3). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C38H41N5NaO8S [M + Na]+ 750,2574, gefunden 750,2568.

Verbindung 7 (258 mg, 0,288 mmol) wurde in 90 %iger wässriger Lösung gelöst. TFA-Lösung (5 ml), dann Et3SiH (149 µl, 0,864 mmol, 3,0 Äquiv.) wurde zugegeben und 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Toluol verdünnt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (CHCl3/MeOH 97/3 → 95/5 → 9/1) gereinigt, um Verbindung 9 (92 mg, 52 %, D-Ribo:L-Lyxo-Verhältnis ~ 1:3) als zu ergeben weißer Feststoff. Rf = 0,74 (CH2Cl2/MeOH 85/15), MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C24H31N5NaO12S [M + Na]+ 636,159, gefunden 636,160.

Verbindung 30 (200 mg, 0,426 mmol), Naphthalin-2-ylmethanthiol 27c (148 mg, 0,853 mmol, 2,0 Äquiv.) und DPAP (10,6 mg, 0,043 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in THF (1,5 ml) gelöst und bestrahlt für 4 × 15 min bei − 40 °C. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (Hexan/Aceton 9/1) gereinigt, um Verbindung 11 (165 mg, 61 %, mit einem D-Xylo:D-Ribo-Verhältnis von ~ 10:1) zu ergeben. als farbloser Sirup. [α]d = + 39,2 (c = 0,12, CHCl3), Rf = 0,20 (Hexan/Aceton 8/2), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7,94 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-6), 7,87–7,74 (m, 4H, aromatisch), 7,68 (s, 1H, aromatisch), 7,50–7,45 (m, 2H, aromatisch), 5,93 (d, J = 6,7 Hz, 1H, H-1 '), 5,68 (dd, J = 8,1, 2,0 Hz, 1H, H-5), 4,29 (d, J = 7,4 Hz, 1H, H-4'), 4,10–4,05 (m, 1H, H-2' ), 3,97 (dd, J = 11,8, 1,0 Hz, 1H, H-5'a), 3,89 (d, J = 3,0 Hz, 2H, Naphthylmethylen CH2), 3,85 (dd, J = 11,8, 2,2 Hz, 1H, H-5'b), 2,72–2,59 (m, 3H, H-3' & SCH2), 0,89 (s, 9H, t-Bu), 0,69 (s, 9H, t-Bu), 0,08 (s, 3H , SiCH3), 0,05 (s, 3H, SiCH3), − 0,19 (s, 3H, SiCH3), − 0,22 (s, 3H, SiCH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 163,4, 150,8 (2C, 2xCO), 140,5 (1C, C-6), 135,0, 133,3, 132,8 (3C, Naphthalin C-4a, C-8a und C-7 ), 128,8, 127,7, 127,7, 127,4, 126,7, 126,3, 126,0 (7C, 7 × aromatisches CH), 102,8 (1C, C-5), 87,6 (1C, C-1'), 79,3 (1C, C-4 '), 77,4 (1C, C-2'), 63,7 (1C, C-5'), 46,2 (1C, C-3'), 36,9 (1C, Naphthylmethylen CH2), 28,2 (1C, SCH2), 26,0, 25,4 (6C, 2 × SiC(CH3)3), 18,2, 17,6 (2C, 2 × t-BuCq), − 4,8, − 5,5, − 5,7 (4C, 4 × SiCH3). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C33H50N2NaO5SSi2 [M + Na]+ 665,2877, gefunden 665,2872.

Verbindung 30 (194 mg, 0,414 mmol), N-Fmoc-Cysteinmethylester 27d (221 mg, 0,621 mmol, 1,5 Äquiv.) und DPAP (10,6 mg, 0,041 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in THF (2) gelöst mL) und 4 × 15 min bei − 80 °C bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (Hexan/Aceton 9/1 → 85/15) gereinigt, um Verbindung 12 (219 mg, 64 %, ~ 15:1 D-Xylo:D-) zu ergeben. Ribo-Verhältnis) als farbloser Sirup. [α]d = + 43,8 (c = 0,42, CHCl3), Rf = 0,19 (Hexan/Aceton 8/2), 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 9,73 (s, 1H, Uracil NH), 7,97 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-6), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2xFmoc ArCH), 7,63 (d, J = 7,4 Hz, 2H, 2xFmoc ArCH), 7,41 (t, J = 7,4 Hz, 2H, 2 × Fmoc ArCH), 7,33 (t, J = 7,4 Hz, 2H, 2 × Fmoc ArCH), 5,98 (d, J = 6,6 Hz, 1H, H-1'), 5,80 (d, J = 8,0 Hz, 1H, CysNH), 5,75 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-5), 4,65 (dd, J = 13,1, 5,5 Hz, 1H, H-α), 4,45 (dt, J = 13,2, 6,7 Hz, 1H, Fmoc CH2a), 4,38 (dd, J = 10,5, 7,1 Hz, 1H, Fmoc CH2b), 4,32–4,26 (m, 1H, H-4'), 4,24 (d, J = 7,0 Hz , 1H, Fluoren H-9), 4,15 (dd, J = 9,1, 6,7 Hz, 1H, H-2'), 3,94 (d, J = 11,7 Hz, 1H, H-5'a), 3,87 (dd, J = 11,8, 1,6 Hz, 1H, H-5'b), 3,81 (s, 3H, COOCH3), 3,10 (dd, J = 13,4, 4,9 Hz, 1H, H-βa), 2,99 (dd, J = 13,3 , 5,7 Hz, 1H, H-βb), 2,80 (dd, J = 14,7, 7,7 Hz, 2H, SCH2), 2,68 (dt, J = 15,2, 9,1 Hz, 1H, H-3'), 0,96 (s, 9H, t-Bu), 0,87 (s, 9H, t-Bu), 0,15 (s, 6H, 2xSiCH3), 0,02 (s, 3H, SiCH3), − 0,10 (s, 3H, SiCH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 171,1 (1C, COOCH3), 163,5 (1C, C-4), 155,7 (1C, Fmoc CO), 150,8 (1C, C-2), 143,7, 141,3 (4C, 4 × Fmoc Cq), 140,5 (1C, C-6), 127,8, 127,1, 125,1, 120,0 (8C, 8 × Fmoc aromatisches CH), 102,8 (1C, C-5), 87,7 (1C, C-1'), 79,1 ( 1C, C-4'), 77,2 (1C, C-2'), 67,3 (1C, Fmoc CH2), 63,6 (1C, C-5'), 53,6, 52,9 (2C, COOCH3 & C-α), 47,1 , 46,7 (2C, Fluoren C-9 & C-3'), 35,4 (1C, C-β), 30,2 (1C, SCH2), 26,0, 25,5 (6C, 2 × SiC(CH3)3), 18,2, 17,7 (2C, 2 × t-BuCq), − 4,6, − 4,73, − 5,5, − 5,7 (4C, 4xSiCH3). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C41H59N3NaO9SSi2 [M + Na]+ 848,341, gefunden 848,358.

Verbindung 30 (200 mg, 0,42 mmol), MesNa 27e (91 mg, 0,56 mmol, 1,3 Äquiv.) und DPAP (10,6 mg, 0,042 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in einer Mischung aus THF (1,7 ml) und MeOH gelöst ( 0,3 mL) und 4 × 15 min bei − 80 °C bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (CHCl3/MeOH 95/5 → 9/1 → 8/2) gereinigt, um Verbindung 13 (253 mg, 80 %, ~ 10:1 D-) zu ergeben. Xylo:D-Ribo-Verhältnis) als weißer Feststoff. [α]d = + 45,5 (c = 0,20, CHCl3), Rf = 0,58 (CH2Cl2/MeOH 8/2), 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ (ppm) 7,80 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-6), 5,78 (d, J = 6,7 Hz, 1H, H-1'), 5,70 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-5), 4,24 (d, J = 7,6 Hz, 1H, H -4'), 4,09 (t, J = 7,6 Hz, 1H, H-2'), 3,87 (dd, J = 11,8, 1,7 Hz, 1H, H-5'a), 3,82 (dd, J = 11,8, 1,9 Hz, 1H, H-5'b), 2,81–2,73 (m, 2H, SCH2), 2,72–2,61 (m, 5H, H-3', CH2SO3Na, SCH2), 0,91 (s, 9H, t-Bu ), 0,82 (s, 9H, t-Bu), 0,11 (s, 6H, 2 × SiCH3), 0,01 (s, 3H, SiCH3), -0,14 (s, 3H, SiCH3). 13C NMR (100 MHz, DMSO) δ (ppm) 162,8, 150,7 (2C, 2 × CO), 139,7 (1C, C-6), 102,4 (1C, C-5), 86,8 (1C, C-1') , 78,6 (1C, C-4'), 77,0 (1C, C-2'), 63,2 (1C, C-5'), 51,5 (1C, CH2SO3Na), 45,6 (1C, C-3'), 28,4, 27,3 (2C, 2 × SCH2), 25,8, 25,5 (6C, 2xSiC(CH3)3), 17,9, 17,4 (2C, 2 × t-BuCq), − 4,7, − 5,1, − 5,7, − 5,8 (4C, 4xSiCH3 ). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C24H45N2Na2O8SSi2 [M + Na]+ 655,1951, gefunden 655,1946.

Verbindung 30 (100 mg, 0,21 mmol), N-Acetyl-2-amino-3,4-di-O-acetyl-2-desoxy-1-thio-β-D-glucopyranose 27f (90 mg, 0,25 mmol, 1,2 Äquiv.) und DPAP (5,3 mg, 0,021 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in einer Mischung aus Toluol (1 mL) und MeOH (0,5 mL) gelöst und 4 × 15 min bei − 80 °C bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (CH2Cl2/Aceton 8/2) gereinigt, um Verbindung 14 (148 mg, 85 %, ~ 12:1 D-Xylo:D-Ribo-Verhältnis) zu ergeben ein weißer Feststoff. [α]d = + 17,9 (c = 1,09, CHCl3), Rf = 0,25 (Hexan/Aceton 7/3) 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7,92 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H -6), 6,41 (d, J = 9,3 Hz, 1H, NHAc), 5,87 (d, J = 6,7 Hz, 1H, H-1'), 5,66 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-5) , 5,15 (t, J = 9,7 Hz, 1H, H-3''), 4,94 (t, J = 9,7 Hz, 1H, H-4''), 4,59 (d, J = 10,3 Hz, 1H, H- 1''), 4,29 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H-4'), 4,13–3,97 (m, 4H, H-6''ab, H-2' und H-2''), 3,83 (dd, J = 21,4, 11,4 Hz, 2H, H-5'ab), 3,67 (dt, J = 8,5, 4,7 Hz, 1H, H-5''), 2,89 (d, J = 7,4 Hz, 1H, SCH2a), 2,85–2,74 (m, 2H, SCH2b & H-3'), 2,07 (s, 3H, AcCH3), 1,97 (s, 6H, 2 × AcCH3), 1,87 (s, 3H, AcCH3), 0,88 ( s, 9H, t-Bu), 0,79 (s, 9H, t-Bu), 0,07 (s, 6H, 2 × SiCH3), − 0,04 (s, 3H, SiCH3), − 0,17 (s, 3H, SiCH3) . 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 171,1, 170,7, 170,2, 169,3 (4C, 4xAcCO), 163,5, 150,8 (2C, 2 × Uracil CO), 140,6 (1C, C-6), 102,7 (1C, C-5), 87,3 (1C, C-1'), 86,4 (1C, C-1″), 79,1 (1C, C-4'), 77,4 (1C, C-2'), 76,0 (1C, C -5″), 73,6 (1C, C-3″), 68,4 (1C, C-4″), 63,8 (1C, C-5'), 62,6 (1C, C-6″), 53,0 (1C, C -2″), 47,4 (1C, C-3'), 29,0 (1C, SCH2), 25,9, 25,5 (6C, 2 × SiC(CH3)3), 23,1, 20,7, 20,6, 20,5 (4C, 4xAcCH3), 18,1, 17,6 (2C, 2 × t-BuCq), -4,6, -4,8, -5,5, -5,8 (4C, 4xSiCH3). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C36H61N3NaO13SSi2 [M + Na]+ 854,3361, gefunden 854,3356.

Verbindung 30 (200 mg, 0,42 mmol), 2,3,4-Tri-O-acetyl-1-thio-β-D-mannopyranose 27 g (186 mg, 0,51 mmol, 1,2 Äquiv.) und DPAP (10,6 mg, 0,042 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in einer Mischung aus Toluol (1 mL), CH2Cl2 (1 mL) und MeOH (1 mL) gelöst und 4 × 15 min bei − 80 °C bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (Hexan/Aceton 8/2 → 7/3) gereinigt, um Verbindung 15 (246 mg, 69 %, ~ 50:1 D-Xylo:D-) zu ergeben. Ribo-Verhältnis) als weißer Feststoff. [α]D = + 2,73 (c = 0,11, CHCl3), Rf = 0,32 (Hexan/Aceton 7/3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 9,83 (s, 1H, NH), 7,89 ( d, J = 8,1 Hz, 1H, H-6), 5,91 (d, J = 7,0 Hz, 1H, H-1'), 5,67 (dd, J = 8,1, 1,6 Hz, 1H, H-5), 5,52 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 5,27 (s, 1H), 5,13 (d, J = 9,9 Hz, 1H, H-4''), 5,05 (dd, J = 10,0, 3,4 Hz, 1H), 4,69 (s, 1H, H-1″), 4,38 (d, J = 7,4 Hz, 1H, H-4'), 4,16–4,11 (m, 2H, H-6″ab), 4,06 (dd, J = 8,9, 7,4 Hz, 1H, H-2'), 3,86 (q, J = 11,6 Hz, 2H, H-5'ab), 3,76–3,67 (m, 1H, H-5''), 3,00 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 2,82 (d, J = 12,1 Hz, 1H, SCH2a), 2,79–2,70 (m, 2H, SCH2b & H-3'), 2,15 (s, 3H, AcCH3), 2,11 (s , 3H, AcCH3), 2,01 (s, 3H, AcCH3), 1,93 (s, 3H, AcCH3), 0,89 (s, 9H, t-Bu), 0,82 (s, 9H, t-Bu), 0,08 (s, 6H, 2xSiCH3), − 0,05 (s, 3H, SiCH3), − 0,17 (s, 3H, SiCH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 170,8, 170,0, 170,0, 169,6 (4C, 4 × AcCO), 163,3, 150,9 (2C, 2 × Uracil CO), 140,2 (1C, C-6), 103,0 ( 1C, C-5), 87,0 (1C, C-1'), 84,6 (1C, C-1''), 78,7 (1C, C-4'), 77,1 (1C, C-2'), 76,7 ( 1C, C-5''), 71,6, 70,5, 65,5 (1C, C-4''), 63,9 (1C, C-5'), 62,9 (1C, C-6''), 53,5, 47,3 (1C , C-3'), 30,4 (1C, SCH2), 25,9, 25,5 (6C, 2 × SiC(CH3)3), 20,6, 20,6, 20,6, 20,5 (4C, 4 × AcCH3), 18,1, 17,7 (2C, 2 × t-BuCq), − 4,6, − 4,8, − 5,5, − 5,7 (4C, 4xSiCH3). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C36H60N2NaO14SSi2 [M + Na]+ 855,3201, gefunden 855,3194.

Verbindung 30 (200 mg, 0,42 mmol), 2,3,4-Tri-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranose 27 h (186 mg, 0,51 mmol, 1,2 Äquiv.) und DPAP (10,6 mg, 0,042 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in einer Mischung aus Toluol (1 mL), CH2Cl2 (1 mL) und MeOH (1 mL) gelöst und 4 × 15 min bei − 80 °C bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (Hexan/Aceton 8/2 → 7/3) gereinigt, um Verbindung 16 (305 mg, 86 %, ~ 18:1 D-Xylo:D-) zu ergeben. Ribo-Verhältnis) als weißer Schaum. [α]d = + 32,9 (c = 0,17, CHCl3), Rf = 0,32 (Hexan/Aceton 7/3) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H -6), 5,89 (d, J = 6,8 Hz, 1H, H-1'), 5,66 (dd, J = 8,1, 1,9 Hz, 1H, H-5), 5,38 (d, J = 3,2 Hz, 1H, H-4''), 5,13 (t, J = 9,9 Hz, 1H, H-2''), 5,02 (dd, J = 10,0, 3,3 Hz, 1H, H-3''), 4,44 (d, J = 9,9 Hz, 1H, H-1''), 4,28 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-4'), 4,15–3,98 (m, 3H, H-2' & H-6''ab) , 3,87 (ddd, J = 29,2, 12,3, 3,9 Hz, 3H, H-5'ab & H-5''), 2,93 (dd, J = 12,4, 4,1 Hz, 1H, SCH2a), 2,82 (t, J = 11,9 Hz, 1H, SCH2b), 2,72 (ddd, J = 21,3, 11,1, 4,5 Hz, 1H, H-3'), 2,08 (s, 3H, AcCH3), 2,05 (s, 3H, AcCH3), 2,01 ( s, 3H, AcCH3), 1,92 (s, 3H, AcCH3), 0,89 (s, 9H, t-Bu), 0,81 (s, 9H, t-Bu), 0,07 (s, 6H, 2xSiCH3), − 0,03 ( s, 3H, SiCH3), − 0,17 (s, 3H, SiCH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm)170,5, 170,0, 169,9, 169,4 (4C, 4 × AcCO), 163,3, 150,8 (2C, 2 × Uracil CO), 140,3 (1C, C-6), 102,8 ( 1C, C-5), 87,2 (1C, C-1'), 85,3 (1C, C-1''), 78,9 (1C, C-4'), 77,3 (1C, C-2'), 74,8 ( 1C, C-5''), 71,6 (1C, C-3''), 67,4 (1C, C-4''), 66,8 (1C, C-2''), 63,7 (1C, C-5') ), 62,0 (1C, C-6''), 47,1 (1C, C-3'), 28,5 (1C, SCH2), 25,9, 25,5 (6C, 2 × SiC(CH3)3), 20,7, 20,6, 20,5 , 20,5 (4C, 4 × AcCH3), 18,1, 17,6 (2C, 2 × t-BuCq), − 4,6, − 4,8, − 5,5, − 5,8 (4C, 4 × SiCH3). ESI-ToF–MS: m/z berechnet für C36H60N2NaO14SSi2 [M + Na]+ 855,3201, gefunden 855,3196.

Verbindung 30 (200 mg, 0,42 mmol), 2,3,4-Tri-O-acetyl-1-thio-β-D-xylopyranose 27i (151 mg, 0,51 mmol, 1,2 Äquiv.) und DPAP (10,6 mg, 0,042). mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in einer Mischung aus Toluol (1 mL) und CH2Cl2 (1 mL) gelöst und 4 × 15 min bei − 80 °C bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (Hexan/Aceton 9/1 → 8/2) gereinigt, um Verbindung 17 (286 mg, 93 %, ~ 12:1 D-Xylo:D-) zu ergeben. Ribo-Verhältnis) als amorpher Feststoff. [α]D = + 4,4 (c = 0,25 CHCl3), Rf = 0,29 (Hexan/Aceton 8/2), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7,86 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H -6), 5,84 (d, J = 6,2 Hz, 1H, H-1'), 5,64 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-5), 5,13 (t, J = 8,6 Hz, 1H, H- 3'), 4,90–4,80 (m, 2H, H-2'' & H-4''), 4,43 (d, J = 8,8 Hz, 1H, H-1''), 4,23 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-4'), 4,13 (dd, J = 11,5, 5,0 Hz, 1H, H-5''a), 4,05 (dd, J = 8,3, 6,8 Hz, 1H, H-2'), 3,82 (s, 2H, H-5'ab), 3,38–3,28 (m, 1H, H-5''b), 2,82 (s, 1H, SCH2a), 2,81 (s, 1H, SCH2b), 2,63–2,54 (m, 1H, H-3'), 1,97 (s, 9H, 3 × AcCH3), 0,88 (s, 9H, t-Bu), 0,78 (s, 9H, t-Bu), 0,06 (s, 6H, 2 × SiCH3), − 0,04 (s, 3H, SiCH3), − 0,17 (s, 3H, SiCH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 169,8, 169,6, 169,1 (3C, 3 × AcCO), 163,4, 150,8 (2C, 2 × Uracil CO), 140,2 (1C, C-6), 102,6 (1C, C-5), 87,7 (1C, C-1'), 84,2 (1C, C-1''), 79,1 (1C, C-4'), 77,4 (1C, C-2'), 72,0 (1C, C-3''), 69,4, 68,4 (2C, C-2'' & C-4''), 65,5 (1C, C-5''), 63,3 (1C, C-5'), 47,2 (1C , C-3'), 27,2 (1C, SCH2), 25,8, 25,4 (6C, 2 × SiC(CH3)3), 20,5 (3C, 3xAcCH3), 18,1, 17,5 (2C, 2 × t-BuCq), − 4,8, − 4,9, − 5,7, − 5,8 (4C, 4 × SiCH3). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C33H56N2NaO12SSi2 [M + Na]+ 783,299, gefunden 783,296.

Verbindung 31 (100 mg, 0,21 mmol), N-Acetyl-2-amino-3,4-di-O-acetyl-2-desoxy-1-thio-β-D-glucopyranose 27f (90 mg, 0,25 mmol, 1,2 Äquiv.) und DPAP (5,3 mg, 0,021 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in einer Mischung aus Toluol (1 mL) und MeOH (0,5 mL) gelöst und 3 × 15 Minuten lang bei −80 °C bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (CH2Cl2/Aceton 8/2) gereinigt, um Verbindung 18 (134 mg, 77 %, ~ 25:1 D-Xylo:D-Ribo-Verhältnis) zu ergeben ein weißer Feststoff. [α]D = + 14,0 (c = 0,10, CHCl3), Rf = 0,28 (CH2Cl2/Aceton 9/1), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7,53 (d, J = 0,9 Hz, 1H, H-6), 5,95 (d, J = 9,3 Hz, 1H, NHAc), 5,89 (d, J = 7,0 Hz, 1H, H-1'), 5,19 (t, J = 9,8 Hz, 1H, H-3 ''), 5,01 (t, J = 9,7 Hz, 1H, H-4''), 4,61 (d, J = 10,4 Hz, 1H, H-1''), 4,33 (d, J = 8,2 Hz, 1H , H-4'), 4,16 (d, J = 2,5 Hz, 1HH-6''a), 4,13 (d, J = 3,8 Hz, 1H, H-6''b), 4,12–4,08 (m, 1H , H-2'), 4,05 (d, J = 9,6 Hz, 1H, H-2''), 3,92 (dd, J = 11,9, 1,1 Hz, 1H, H-5'a), 3,86 (dd, J = 11,8, 1,8 Hz, 1H, H-5'b), 3,71 (ddd, J = 9,8, 5,5, 2,7 Hz, 1H, H-5''), 2,94 (d, J = 1,6 Hz, 1H, SCH2a) , 2,92 (s, 1H, SCH2b), 2,82 (dt, J = 17,7, 9,0 Hz, 1H, H-3'), 2,14 (s, 3H, OAcCH3), 2,04 (s, 6H, 2 × OAcCH3), 1,95 , 1,94 (2 s, 2 × 3H, NHAcCH3 & Thymin CH3), 0,96 (s, 9H, t-Bu), 0,85 (s, 9H, t-Bu), 0,15 (s, 3H, SiCH3), 0,14 (s , 3H, SiCH3), 0,01 (s, 3H, SiCH3), − 0,13 (s, 3H, SiCH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 171,3, 171,0, 170,2, 169,5 (4C, 4 × AcCO), 163,9, 151,0 (2C, C-2, C-4), 135,7 (1C, C-6) , 111,4 (1C, C-5), 87,2 (1C, C-1'), 86,7 (1C, C-1''), 78,7 (1C, C-4'), 76,8 (1C, C-2') , 76,2 (1C, C-5''), 73,6 (1C, C-3''), 68,4 (1C, C-4''), 63,8 (1C, C5'), 62,7 (1C, C-6') '), 53,3 (1C, C-2''), 47,4 (1C, C-3'), 29,3 (1C, SCH2), 26,2, 25,7 (6C, 2xSiC(CH3)3), 23,3 (1C, NH AcCH3 ), 20,9, 20,8, 20,7 (3C, 3xOAcCH3), 18,4, 17,8 (2C, 2 × t-BuCq), 12,4 (1C, Thymin CH3), − 4,4, − 4,6, − 5,2, − 5,3 (4C, 4 × SiCH3), MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C37H63N3NaO13SSi2 [M + Na]+ 868,3518, gefunden 868,3525.

Verbindung 29 (200 mg, 0,41 mmol), n-BuSH 27b (360 µL, 3,3 mmol, 8,0 Äquiv.) und DPAP (10,6 mg, 0,041 mmol, 0,1 Äquiv.) wurden in THF (1 ml) gelöst und 4 Stunden lang bestrahlt × 15 Min. bei 0 °C. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Säulenchromatographie (Hexan/Aceton 9/1) gereinigt, um Verbindung 2019 (164 mg, 69 % mit einem D-Arabino:D-Ribo-Verhältnis von ~ 20:1) als farblosen Sirup zu ergeben. [α]d = + 16,2 (c = 0,26, CHCl3), Rf = 0,32 (Hexan/Aceton 8/2), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 9,77 (s, 1H, NH), 7,62 ( d, J = 8,1 Hz, 1H, H-6), 6,23 (d, J = 4,4 Hz, 1H, H-1'), 5,69 (dd, J = 8,1, 1,6 Hz, 1H, H-5), 4,35 (t, J = 8,8 Hz, 1H, H-3'), 4,11 (dd, J = 13,3, 1,8 Hz, 1H, H-5'a), 4,01 (dd, J = 13,1, 2,7 Hz, 1H, H -5'b), 3,75 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-4'), 2,89–2,81 (m, 2H, H-2' & SCH2a), 2,57–2,50 (m, 1H, SCH2b), 2,41 (td, J = 7,2, 2,0 Hz, 2H, SCH2CH2CH2CH3), 1,47 (dt, J = 14,6, 7,4 Hz, 2H, CH2CH2CH2CH3), 1,35–1,29 (m, 2H, CH2CH2CH2CH3), 1,06 (dt, J = 11,3 , 4,8 Hz, 28H, 8 × i-PrCH3 und 4 × i-PrCH), 0,86 (t, J = 7,3 Hz, 3H, CH2CH2CH2CH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) 163,9, 150,8 (2C, 2xCO), 102,0 (1C, C-5), 84,2 (2C, C-1', C-4'), 60,4 (1C, C -5'), 49,3 (1C, C-2'), 33,2 (1C, SCH2CH2CH2CH3), 31,4 (1C, SCH2CH2CH2CH3), 29,0 (1C, SCH2), 21,9 (1C, CH2CH2CH2CH3), 17,5, 17,4, 17,3, 17,2 , 17,1, 17,1 (8C, 8 × i-PrCH3), 14,1, 13,7, 13,0, 12,8, 12,6 (5C, 4 × i-PrCH & CH2CH2CH2CH3). MALDI-ToF MS: m/z berechnet für C26H48KN2O6SSi2 [M + K]+ 611,262, gefunden 611,317.

Pf3D7 und PfRKL-9 wurden nach dem von Trager und Jensen33 beschriebenen Verfahren kultiviert. Kurz gesagt, Kulturmedien, die für die Parasitenkultur verwendet werden, ergänzt mit dem vollständigen RPMI 1640, 0,2 % NaHCO3, 0,5 % AlbuMax II, 0,1 mM Hypoxanthin, 25 mg/ml Gentamicin, bei 37 °C in menschlichen O+-Erythrozyten und gehalten in einer Mischgasumgebung (5 % O2, 5 % CO2 und 90 % N2). Um die morphologischen Veränderungen des Parasiten zu untersuchen, muss ein Blutausstrich angefertigt werden. Ein dünner Blutfilm wurde an der Luft getrocknet, mit Methanol fixiert und vor dem Färben trocknen gelassen. Blutausstriche wurden 15 Minuten lang mit einer 7,5 %igen Giemsa-Lösung (pH-Wert 7,2) gefärbt. Eine lichtmikroskopische Analyse wurde durchgeführt, um die Hemmwirkung von Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen gegen Pf3D7 und PfRKL-9 zu bewerten.

Ein auf SYBR Green I basierender Fluoreszenztest wurde durchgeführt, um die wachstumshemmende Wirkung der 26 Verbindungen zu messen, und ein weiterer dosisabhängiger Test gegen Pf3D7 und PfRKL-9 (indischer Feldstamm, Quelle NIMR, Neu-Delhi, Indien) wurde in verschiedenen Konzentrationen durchgeführt34 . Kurz gesagt, mit Pf3D7 und PfRKL-9 parasitierte Erythrozyten (Trophozoitenstadium mit 1 % Parasitämie) wurden mit nicht infizierten Erythrozyten bei einem konstanten Hämatokrit von 2 % im Kulturmedium verdünnt. Parasitierte Erythrozyten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Verbindungen im Bereich von 1 µM bis 10 µM behandelt, während DMSO als Kontrolle diente. Dreifache Vertiefungen mit parasitierten Erythrozyten, die mit Verbindungen behandelt wurden, wurden nach Inkubation bei 37 °C für einen Zyklus des Parasitenwachstums in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Die Wachstumshemmung von Parasiten durch Verbindungen wurde anhand der Fluoreszenzintensität berechnet, die bei einer Anregung bei 485 nm und einem Emissionsspektrum bei 530 nm gemessen wurde. Die Wachstumshemmung (%) wurde wie folgt berechnet: % Hemmung = [1 − % Parasitämie (Behandlung)/% Parasitämie (Kontrolle)] *100. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.

Die Zytotoxizität gegenüber der humanen embryonalen Nierenzelllinie (ATCC) wurde unter Verwendung des MTT-Farbstoffs35 bestimmt. Um die Zytotoxizität der Verbindungen zu messen, verwendeten wir MTT-Farbstoff zum Nachweis lebender/toter Zellen. RAW-Zellen wurden bei 37 °C, 5 % CO2 in sterilen 75-cm3-Kulturflaschen (Corning) in komplettem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-Kulturmedium (a), ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS), Gentamicin (40 mg), gelagert /ml), wobei das Medium dreimal wöchentlich gewechselt wird. Die Monoschichten wurden gewaschen, gezählt, in Komplettmedium verdünnt, auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (5000 Zellen/Vertiefung) verteilt und anschließend weitere 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Testverbindungen und DMSO wurden in dreifacher Ausfertigung zugegeben. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 37 °C wurde der Überstand entfernt und 100 µL MTT-Lösung in komplettem DMEM in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation bei 37 °C. Die Kulturplatten wurden in einem Spektrophotometer (Tecan Infinite M200, Nanoquant, UK) mit einem 490-nm-Filter ausgelesen und die zytotoxischen Konzentrationen wurden anhand einer Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt.

Menschliche Erythrozyten stammten von der Rotary Blood Bank, Tughlakabad Institutional Area, Neu-Delhi, Indien. Die Wirkung der Verbindungen auf Erythrozyten wurde durch einen hämolytischen Assay überprüft36. Kurz gesagt: Erythrozytensuspension mit 10 % (v/v), gewaschen mit 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) und erneut in 1 × PBS resuspendiert. Die Erythrozytensuspension wurde mit den Verbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 in unterschiedlichen Konzentrationen (0,5, 1, 5, 10 und 20 μM) 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und der Überstand wurde auf Absorption bei 415 nm untersucht. Als Positivkontrolle wurde Triton X-100 mit 1 % (v/v) verwendet. Das Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Das mitochondriale Membranpotenzial der Malariaparasiten wurde mithilfe des MitoProbe™ JC-1-Assays wie zuvor beschrieben24 bestimmt. Kurz gesagt, Parasiten im Trophozoitenstadium (10–12 % Parasitämie) wurden 3 Stunden lang bei 37 °C im CO2-Inkubator mit der IC50-Konzentration der Verbindungen 7, 16, 17, 18 und 1 behandelt. Die Proben wurden mit 1 × PBS durch Zentrifugation bei 500 × g für 2 Minuten bei RT gewaschen. Jeder Probe wurde frisch zubereiteter JC-1-Farbstoff mit einer Arbeitskonzentration von 5 µg/ml zugesetzt. Die Inkubation erfolgte 30 Minuten lang bei 37 °C in einem CO2-Inkubator. Die Zellen wurden zweimal mit 1 × PBS gewaschen. Das Spektrofluorometer wurde zur Beobachtung des mitochondrialen Membranpotentials verwendet, indem die Fluoreszenzintensitäten des Parasitenlysats bei der Anregungswellenlänge (520 nm) bzw. der Emissionswellenlänge (590 nm) gemessen wurden. Die In-vivo-Zellbildgebung erfolgte mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie Olympus fluoview 3000. Die Bildgebung lebender Zellen wurde unter einem 100-fachen Objektiv (Ölimmersion) und einem Bandpassfilter bei 355–460 nm beobachtet. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und es werden nur repräsentative Zahlen angezeigt (Abb. 6).

Die antiplasmodiale Aktivität der Hit-Verbindung 7 wurde im Mäusemodell mithilfe des zuvor beschriebenen Protokolls untersucht37. Kurz gesagt, wurde Mäusen eine intraperitoneale Injektion von 1 × 107 Plasmodium berghei ANKA-infizierten Erythrozyten, verdünnt mit sterilem 1 × PBS, injiziert. In jede Gruppe wurden fünf Mäuse genommen. Zur Überprüfung der Infektion wurden dünne Abstriche aus dem Schwanzblut von Mäusen angefertigt. Nach der Infektion wurde P. berghei-infizierten Mäusen an sieben aufeinanderfolgenden Tagen nach der Infektion täglich intraperitoneal Verbindung 7 mit einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Mit 1xPBS behandelte Mäuse wurden als Vehikelkontrolle gehalten. Von Tag 1 bis Tag 7 wurden dünne Blutausstriche angefertigt, um die Parasitämie zu zählen, und die Mäuse wurden 21 Tage lang beobachtet, um die mittlere Überlebenszeit zu berechnen. Die Daten wurden berechnet und als prozentualer Anstieg der Parasitämie dargestellt. Alle Tierversuche wurden gemäß den anerkannten Standardverfahren durchgeführt36. Die Studie wurde vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) der Jawaharlal Nehru University, Neu-Delhi, Indien, genehmigt; und das Komitee zur Kontrolle und Überwachung von Tierversuchen (CPCSEA) der indischen Regierung.

Die Daten wurden als einseitige Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, um die Signifikanz zwischen den Mittelwerten zu bestimmen, die für die Kontrolle und nach der Behandlung mit Verbindungen erhalten wurden. Der Dunnett-Test wurde zum Vergleich von Behandlung und Kontrolle verwendet und die statistische Signifikanz wurde auf P ≤ 0,01 festgelegt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor (AB) erhältlich.

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Diese Forschung wurde vom Nationalen Büro für Forschung, Entwicklung und Innovation Ungarns finanziert (K 132870 an AB). SS dankt dem Drug and Pharmaceuticals Research Program (DPRP) (Projekt Nr. P/569/2016-1/TDT) und DST-SERB (Projekt Nr. CRG/2019/002231). VS ist Empfänger des SERB-NPDF (PDF/2017/001525) des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (DST) der indischen Regierung, Neu-Delhi. NS dankt dem Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) für ein Senior Research Fellowship. Wir danken der Advanced Instrumentation Research Facility (AIRF) der Jawaharlal Nehru University für die Bildgebung lebender Zellen. Wir danken dem National Institute of Malaria Research für die Bereitstellung der PfRKL-9-Chloroquin-resistenten Linie.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Debrecen.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Miklós Bege, Vigyasa Singh und Neha Sharma.

Abteilung für Pharmazeutische Chemie, Universität Debrecen, Egyetem Tér 1, Debrecen, 4032, Ungarn

Miklós Bege, Nóra Debreczeni, Ilona Bereczki, Pál Herczegh und Anikó Borbás

Institut für Gesundheitsindustrie, Universität Debrecen, Nagyerdei Körút 98, Debrecen, 4032, Ungarn

Miklós Bege

MTA-DE Molecular Recognition and Interaction Research Group, Universität Debrecen, Egyetem Tér 1, Debrecen, 4032, Ungarn

Miklós Bege

Spezialzentrum für Molekulare Medizin, Jawaharlal Nehru University, Neu-Delhi, 110067, Indien

Vigyasa Singh & Shailja Singh

Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie, College of Pharmacy, University of Arizona, Tucson, AZ, 85721, USA

Vigyasa Singh

Labor für translationale Chemie und Wirkstoffforschung, Fachbereich Chemie, Hansraj College, Universität Delhi, Delhi, Indien

Neha Sharma und Brijesh Rathi

Nationales Labor für Virologie, Universität Pécs, Ifjúság Útja 20, Pécs, 7624, Ungarn

Ilona Bereczki & Anikó Borbás

Fakultät für Chemie, Miranda House, Universität Delhi, Delhi, 110007, Indien

Poonam

Delhi School of Public Health, Institution of Eminence (IoE), Universität Delhi, Delhi, 110007, Indien

Poonam und Brijesh Rathi

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AB, SS, PH und BR entwickelten die Konzepte und gestalteten die Experimente. MB, VS, NS, ND, IB und P. führten die Experimente durch und analysierten die Daten unter der Aufsicht von AB, PH, SS und BR. MB, VS, P., SS, BR und AB verfassten den ersten Entwurf des Manuskripts. AB und BR haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. AB, SS und BR waren für die Finanzierungsbeschaffung verantwortlich. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Brijesh Rathi, Shailja Singh oder Anikó Borbás.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bege, M., Singh, V., Sharma, N. et al. Antiplasmodiale In-vitro- und In-vivo-Bewertung zuckermodifizierter Nukleosidanaloga. Sci Rep 13, 12228 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39541-4

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Eingegangen: 13. April 2023

Angenommen: 26. Juli 2023

Veröffentlicht: 28. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39541-4

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