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Feb 07, 2024

Zweikernige und einkernige Metall(II)-Polypyridylkomplexe gegen Arzneimittel

Malaria Journal Band 21, Artikelnummer: 386 (2022) Diesen Artikel zitieren 1423 Zugriffe auf 2 Altmetric Metrics-Details Malaria bleibt eine der bösartigsten und tödlichsten parasitären Krankheiten der Welt.

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Malaria ist nach wie vor eine der bösartigsten und tödlichsten parasitären Krankheiten der Welt, insbesondere in Afrika und Südostasien. Das weit verbreitete Vorkommen Artemisinin-resistenter Plasmodium falciparum-Stämme aus der Greater Mekong-Subregion ist alarmierend. Dies behindert die Volkswirtschaften und stellt ein großes Hindernis für die wirksame Bekämpfung und Eliminierung von Malaria weltweit dar. Es ist klar, dass ein wirksames Malariamedikament dringend benötigt wird.

Die zweikernigen und einkernigen Kupfer(II)- und Zink(II)-Komplexe wurden in ethanolischer Lösung synthetisiert und durch verschiedene physikalische Messungen charakterisiert (FTIR, CHN-Elementaranalyse, Löslichkeit, ESI-MS, UV-sichtbar, Leitfähigkeit und magnetisches Moment sowie NMR). . Die Röntgenkristallstruktur des Dikupfer(II)-Komplexes wurde bestimmt. Die in vitro hämolytischen Aktivitäten dieser Metallkomplexe wurden spektroskopisch an B+-Blut bewertet, während die Anti-Malaria-Wirkung in vitro an arzneimittelempfindlichem Plasmodium falciparum 3D7 (Pf3D7) im Blutstadium und Artemisinin-resistentem Plasmodium falciparum IPC5202 (Pf5202) mit Fluoreszenzfarbstoff durchgeführt wurde . Die Wirkungsweise von Metallkomplexen wurde durchgeführt, um die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies mithilfe von PNDA- und DCFH-DA-Farbstoffen, die JC-1-Depolarisierung des mitochondrialen Membranpotentials, die Malaria-20S-Proteasomhemmung mit Parasitenlysat und morphologische Studien mithilfe von Giemsa- und Hoechst-Färbungen zu bestimmen.

Kupfer(II)-Komplexe zeigten eine Anti-Malaria-Wirkung sowohl gegen Pf3D7 als auch gegen Pf5202 im submikromolaren bis mikromolaren Bereich. Die Zink(II)-Komplexe waren gegen Pf3D7 mit ausgezeichnetem therapeutischen Index wirksam, stießen jedoch auf völlige Resistenz gegen Pf5202. Von den vier war der zweikernige Kupfer(II)-Komplex gegen beide Stämme am wirksamsten. Die Zink(II)-Komplexe verursachten keine Hämolyse der Erythrozyten, während Kupfer(II)-Komplexe mit zunehmender Konzentration eine verstärkte Hämolyse induzierten. Weitere mechanistische Studien beider Kupfer(II)-Komplexe an Pf3D7- und Pf5202-Stämmen zeigten die Induktion von ROS, die Hemmung des 20S-Malaria-Proteasoms, den Verlust des Mitochondrienmembranpotentials und morphologische Merkmale, die auf Apoptose hinweisen.

Das zweikernige [Cu(phen)-4,4′-bipy-Cu(phen)](NO3)4 ist hochwirksam und kann die gesamte Arzneimittelresistenz von Pf5202 gegenüber Chloroquin und Artemisinin überwinden. Die anderen drei Kupfer(II)- und Zink(II)-Komplexe waren nur gegenüber dem arzneimittelempfindlichen Pf3D7 wirksam, wobei letzteres keine Hämolyse der Erythrozyten verursachte. Ihre Wirkungsweise umfasst mehrere Ziele.

Die WHO meldete weltweit schätzungsweise 241 Millionen Malariafälle in 85 endemischen Ländern, mit geschätzten 627.000 Todesfällen durch Malaria im Jahr 2020 [1]. Die Situation wird durch die Ausbreitung von Arzneimittelresistenzen auch gegen Artemisinin-basierte Kombinationstherapie (ACT) und das unabhängige Auftreten von Kelch13-Mutationen, die die Ursache der Artemisinin-Resistenz sind, verschärft [2]. Aufgrund der zunehmenden Unterdrückung immer mehr Mitglieder im Medikamentencocktail der ACT aufgrund von Medikamentenresistenzen besteht ein dringender Bedarf an der Entdeckung neuer Antimalariamedikamente.

Die Entwicklung von Metallkomplexen ist aufgrund der einzigartigen strukturellen und physikalisch-chemischen Möglichkeiten, die mit organischen Molekülen nicht erreicht werden können, ein attraktives alternatives Arzneimitteldesign, und diese Metallo-Malariamedikamente bieten eine potenzielle Lösung für Arzneimittelresistenzen [3,4,5,6,7] . Unter vier kationischen Komplexen mit gemischten Liganden ist (N-Benzoyl-N′,N′-di(2-hydroxyethyl)thioureato)(4,4′-di-tert-butyl-2,2′-bipyridyl)platin(II) Chlorid war sowohl gegen Chloroquin-empfindliche als auch gegen Chloroquin-resistente Malariastämme stark wirksam [8]. Von der Liste der verschiedenen Metall-Chloroquin-Komplexe zeigten drei der sechs getesteten Komplexe eine größere Anti-Malaria-Aktivität gegen den Chloroquin-resistenten Malariastamm [9]. In einer anderen Studie war die Wirksamkeit eines der getesteten Kupfer(II)-Komplexe 32-mal höher als die von Chloroquin und 260-mal höher als die eines anderen Antiprotozoen-Medikaments, Toltrazuril, was darauf hindeutet, dass Kupferkomplexe gute Kandidaten sind [3]. Im Vergleich dazu war eine Leitverbindung [(η5-C5R5)Ru(PPh3)(phen)][PF6] in Pf3D7, einem Chloroquin/Artemisinin-empfindlichen Stamm von Plasmodium falciparum, nur weniger als zweimal wirksamer als Chloroquin, war es aber nicht so gut wie Chloroquin oder Dihydroartemisinin gegen den Artemisinin-resistenten Stamm Pf5202 [7].

Neben Kupfer(II)-Komplexen sind Zinkkomplexe aufgrund ihrer geringen oder geringen Toxizität attraktiv. Die Komplexierung von Zink(II) mit bioaktiven Liganden kann jedoch deren Anti-Malaria-Eigenschaft verstärken, ist jedoch möglicherweise nicht immer mit anderen Anti-Malaria-Medikamenten vergleichbar [10, 11]. Bisher sind Anti-Malaria-Metallkomplexe meist einkernig. Obwohl einige Dikupfer(II)- und Dizink(II)-Komplexe bekanntermaßen krebshemmende Eigenschaften haben, scheint es jedoch keinen Bericht über ihre Anti-Malaria-Eigenschaften zu geben [12,13,14,15]. Hierin berichtet das Manuskript über die Synthese und Charakterisierung zweier zweikerniger Metall(II)-Komplexe (Cu und Zn) mit einem bioaktiven 1,10-Phenanthrolin (phen) und einem nicht bioaktiven 4,4'-Bipyridin (4,4'- bipy) als Brückenligand und ihre Anti-Malaria-Eigenschaft im Vergleich zu ihren jeweiligen einkernigen Metall(II)-Komplexen mit zwei Phen-Liganden.

Im Handel erhältliche Ausgangsmaterialien oder Chemikalien waren von analytischer Reagenzienqualität und von höchster verfügbarer Reinheit. Alle wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet. Chemikalien: 1,10-Phenanthrolin (Acros Organics, USA), 4,4′-Bipyridin (Merck, Deutschland), Kupfer(II)-nitrat-Trihydrat (Alfa Aesar, USA) und Zink(II)-nitrat-Hexahydrat (Acros Organics, Belgien). ). Alle Glaswaren wurden gründlich mit verdünntem Königswasser, dann mit hochreinem Wasser gewaschen und über Nacht in einem Ofen getrocknet. Alle synthetisierten Metall(II)-Komplexe wurden durch Saugfiltration gesammelt, mit kaltem Ethanol gewaschen, in einem Ofen getrocknet und vor der Charakterisierung in einem Exsikkator mit Kieselgel aufbewahrt. Alle Puffer-Stammlösungen für den biologischen Test wurden 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert.

Das Paar [M(phen)2](NO3)2 (M = Kupfer oder Zink) wurde auf die gleiche Weise wie hier beschrieben synthetisiert. 1,10-Phenanthrolin-Lösung wurde zu einer ethanolischen Lösung von Metall(II)-nitratsalz (30 ml 1:1 v/v Wasser:Ethanol) gegeben. Nach 2-stündigem Erhitzen und kontinuierlichem Rühren (55 °C; 525 U/min) wurde jede Lösung filtriert und ergab beim langsamen Eindampfen einen Niederschlag.

[Cu(phen)2](NO3)2·H2O (1) Farbe (% Ausbeute): Grün (70,28 %). FTIR (ATR) cm−1: 3188 (νs (OH) br), 3061 (vs (CH) m), 1429–1608 (vs (C = C) m), phen: 850 und 720 (vs (CNC) m ). Elementaranalyse: Anal. Berechnet. für CuC24H18N6O7: C, 50,93 %; H, 3,21 %; N, 14,85 %. Gefunden: C, 50,67 %; H, 3,04 %; N, 15,12 %. Magnetisches Moment, µeff in BM: 1,84. ESI-MS( +) in wässrigem Methanol: m/z 484,8 (100 %), 486,7 (49 %) (ber. m/z für [63Cu(phen)2(NO3)]+, 485,3; [65Cu(phen )2(NO3)]+, 487,1).

[Zn(phen)2](NO3)2·2H2O (2). Farbe (% Ausbeute): Weiß (73,74 %). FTIR (ATR) cm−1: 3180 (νs (OH) br), 3062 (vs (CH) m), 1495–1581 (vs (C = C) m), phen: 846 und 723 (vs (CNC) m ). – 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d, δ ppm): 8,049 (4H, t, Ar-H); 8,320 (4H, s, Ar-H); 8,733 (4H, d, Ar-H); 8,945 (4H, d, Ar-H). 13C-NMR (400 MHz, DMSO-d, δ ppm): 126,640 (CAr); 128.022 (CAr); 129,605 (CAr); 140,284 (CAr); 140,941 (-CAr = N); 149,608 (-CAr-N). Elementaranalyse: Anal. Berechnet. für ZnC24H20N6O8: C, 49,20 %; H, 3,44 %; N, 14,35 %. Gefunden: C, 49,11 %; H, 2,89 %; N: 14,33 %. Magnetisches Moment, µeff in BM: 0,30. ESI-MS( +) in wässrigem Methanol: m/z 485,9 (67 %), 487,9 (40 %) (ber. m/z für [64Zn(phen)2(NO3)]+, 486,3;[66Zn(phen )2(NO3)]+, 488,3).

[Cu(phen)](NO3)2 (0,7355 g, 2 mmol) wurde in 1:1 v/v Wasser:Ethanol-Lösung gelöst und eine ethanolische Lösung von 4,4'-Bipyridin (0,1560 g, 1 mmol) wurde zugegeben in die Kupferkomplexlösung. Dem Gemisch wurde außerdem Ethylendiamin (66,85 µl, 1 mmol) zugesetzt. Die Mischung wurde erhitzt und 2 Stunden lang bei 50 °C und 700 U/min gerührt. Anschließend wurde die Lösung 5 Stunden lang im Wasserbad erhitzt und bei Raumtemperatur eingedampft. Nach 2 Tagen bildeten sich dunkelgrüne Kristalle. Die Kristalle wurden filtriert und mit einer 1:2 v/v Wasser:Ethanol-Lösung umkristallisiert. Die umkristallisierten Kristalle wurden dann filtriert und über Nacht im Ofen bei 55 °C getrocknet.

[Cu(phen)(NO3)(H2O)-4,4′-bipy-Cu(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (3). Farbe (% Ausbeute): Grün (35,69 %). FTIR (ATR) cm−1: Bipy: 1610 (gegenüber (C = C) m), 1026 (gegenüber (Pyridyl-Biegung in der Ebene) m), Phen: 856 und 721 (gegenüber (CNC) m). Elementaranalyse: Anal. Berechnet. für Cu2C34H28N10O14: C, 44,02 %; H, 3,04 %; N, 15,10 %. Gefunden: C, 44,17 %; H, 2,82 %; N, 14,95 %. Magnetisches Moment, µeff in BM: 1,37. ESI-MS( +) in wässrigem Dimethylsulfoxid: m/z 237,9 (100 %), 382,2 (30,9 %) (ber. m/z für [63Cu(phen)-4,4'-bipy-63Cu(phen) (NO3) + 3H]3+, 237,8; [63Cu(phen)(NO3)-4,4′-bipy-63Cu(phen)-(NO3)-H]2+, 382,2).

4,4'-Bypyridin (10 ml 95 %iges Ethanol; 0,1571 g; 1 mmol) wurde zu einer ethanolischen Lösung von Zink(II)nitrat-Hexahydrat (10 ml 95 %iges Ethanol; 0,6147 g; 2 mmol) gegeben. Die Lösung wurde erhitzt und 30–45 Minuten lang bei 55 °C und 700 U/min gerührt. 1,10-Phenanthrolin (10 ml 95 %iges Ethanol; 0,3604 g; 2 mmol) wurde gelöst und in die erhitzte Mischung gegossen. Die Lösung wurde weiter erhitzt und 2 Stunden lang bei 55 °C und 700 U/min gerührt. Beim Rühren auf einer heißen Platte begann sich weißes Pulver zu bilden. Das Pulver wurde durch Saugfiltration gesammelt, mit eiskaltem Ethanol gewaschen und über Nacht im Ofen getrocknet.

[Zn(phen)(NO3)-4,4′-bipy-Zn(phen)(NO3)](NO3)2·2H2O (4). Farbe (% Ausbeute): Weiß (16,64 %). FTIR (ATR) cm−1: Bipy: 1610 (gegenüber (C = C) m), 1026 (gegenüber (Pyridyl-Biegung in der Ebene) m), Phen: 848 und 725 (gegenüber (CNC) m). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d, δ ppm): 7,396 (4H, d, Ar-H); 8,123 (4H, t, Ar-H); 8,245 (4H, s, Ar-H); 8,698 (4H, d, Ar-H); 8,894 (4H, t, Ar-H); 9,128 (4H, d, Ar-H). 13C-NMR (400 MHz, DMSO-d, δ ppm): 126,219–129,576 (CAr); 139.893–140.436 (CAr); 140,903 (= CAr-N); 144,927 (-CAr-N); 149.580 (-CAr-CAr); 151,010 (-CAr = N). Elementaranalyse: Anal. Berechnet. für Zn2C34H28N10O14: C, 43,84 %; H, 3,03 %; N: 15,04 %. Gefunden: C, 43,80 %; H, 3,44 %; N, 14,71 %. Magnetisches Moment, µeff in BM: 1,06. ESI-MS( +) in wässrigem Dimethylsulfoxid: m/z 383,6 (100 %) (berechnet für [64Zn(phen)(NO3)-4,4′-bipy-64Zn(phen)(NO3)]2+ , 384.2).

FTIR-Spektren des Metall(II)-Komplexes wurden mit einem Shimadzu IRAffinity-1S über einen Bereich von 400–4000 cm−1 aufgenommen. Die Elementaranalyse von Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff wurde auf einem Perkin Elmer CHNS/O 2400 Series II von der Universiti Malaya (UM) durchgeführt. NMR-Spektren wurden mit einem FT-NMR ECX 400 (400 MHz)-Spektrometer unter Verwendung von deuteriertem Dimethylsulfoxid (DMSO-d6) als Lösungsmittel ohne interne Referenz (Universiti Malaya) erhalten.

Die Löslichkeit von Metall(II)-Komplexen wurde unter Verwendung verschiedener Lösungsmitteltypen bestimmt, d. h. doppelt destilliertem Wasser, 95 %igem Ethanol, Methanol und Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Positivionen-Elektrospray-Ionisations-Massenspektren (ESI-MS) von etwa 200 ng/μL von (i) einkernigen Metall(II)-Komplexen, gelöst in Wasser-Methanol (1:4 v/v), und (ii) Dimetall( II) Komplexe in Wasser-Dimethylsulfoxid (9:1 v/v) wurden mit dem Thermo Finnigan LCQ-Massenspektrometer (National University of Singapore) durch Infusionsverfahren (10 μL/min) mit einer erhitzten Kapillartemperatur von 60 °C und einer Kapillarspannung erhalten von 21 V.

Die spektroskopische Messung im sichtbaren Bereich wurde mit einem Perkin Elmer Lambda 25-Spektrophotometer mit einer Quarzküvette mit 1 cm optischem Weg im Bereich von 200–400 cm−1 für den ultravioletten (UV) Bereich und 400–1000 cm−1 für den sichtbaren (Vis) Bereich durchgeführt . Zur Messung der Leitfähigkeit der Metall(II)-Komplexlösung wurde ein Tisch-Leitfähigkeitsmessgerät vom Typ PC 2700 von EUTECH Instruments verwendet. Die magnetische Suszeptibilität wurde mit einer magnetischen Suszeptibilitätswaage MK 1 von Sherwood Scientific bei Raumtemperatur bestimmt.

Die Metall(II)-Komplexe (1) und (2) wurden in doppelt destilliertem Wasser (DD-Wasser) gelöst und für Charakterisierungsstudien weiter mit DD-Wasser verdünnt, während sie für biologische Studien mit Medium weiter verdünnt wurden. Andererseits wurden die Metall(II)-Komplexe (3) und (4) in DMSO gelöst und für Charakterisierungsstudien weiter mit dd-Wasser verdünnt, während sie für biologische Studien mit Medium verdünnt wurden.

Intensitätsdaten für einen grünen Blockkristall, 0,40 × 0,30 × 0,20 mm des Kupfer(II) (3), wurden bei 293 K (20 °C) gesammelt, indem der Kristall auf einer Quarzfaser auf einem SuperNova Dual-Diffraktometer von Agilent Technologies mit Atlas-Detektor montiert wurde , unter Verwendung einer Supernova-Cu-Kα-Strahlung (λ = 1,54184 Å). Zur Datenerfassung und Datenreduktion wurde die Agilent CrysAlis PRO-Software verwendet. Die strukturelle Lösung wurde mit der SHELXTL-Programmsuite [16] durchgeführt. Die Struktur wurde mit direkten Methoden gelöst, um die schweren Atome zu lokalisieren, gefolgt von Differenzkarten für die leichten Nichtwasserstoffatome. Alle Nichtwasserstoffatome wurden mit anisotropen thermischen Parametern verfeinert und durch ein Vollmatrixverfahren der kleinsten Quadrate unter Verwendung von Olex [17] verfeinert. Die Molekülstruktur des Komplexes (3) ist in Abb. 1 dargestellt. Die kristallographischen Daten sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 zusammengefasst und wurden beim Cambridge Crystallographic Centre (CCDC Nr. 2158992) hinterlegt, das unter http:// erhältlich ist. www.ccdc.cam.ac.uk/Community/Request a structure/Pages/Data Request.aspx. Ausgewählte Bindungsabstände und -winkel sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S2 aufgeführt.

Ortep-Diagramm des Dikupfer(II)-Komplexes (3) mit markierten Nichtwasserstoffatomen (wobei zwei unkoordinierte Nitratanionen nicht gezeigt sind)

Durch Auflösen der Verbindungen in ihren jeweiligen Lösungsmitteln wurden Reihen von 10-mM-Stammlösungen hergestellt: Phen und 4,4′-Bipy in 95 % Ethanol; Cu(NO3)2·3H2O, Zn(NO3)2·6H2O, (1) und (2) in doppelt destilliertem Wasser; (3) und (4) in DMSO. Alle Stammlösungen wurden mit doppelt destilliertem Wasser weiter verdünnt, um 10 ml 30 µM, 1 mM und 5 mM für ihre jeweiligen Studien zu erhalten, nämlich. 30 µM für ultraviolette Spektralstudien, 1 mM für Leitfähigkeitsmessungen und 5 mM für sichtbare Spektralstudien. Für die Wasser-DMSO-Lösungen beider Komplexe (3) und (4) enthalten die 30 µM-, 1 mM- und 5 mM-Lösungen 3 % DMSO, 10 % DMSO bzw. 50 % DMSO. Die Absorption bei λmax und die Leitfähigkeit der wässrigen Lösungen wurden nach 0, 24, 48 und 72 Stunden gemessen. Anschließend wurden das molare Absorptionsvermögen und die molare Leitfähigkeit der Metall(II)-Komplexlösungen und ihrer Vorläufer berechnet.

Der arzneimittelempfindliche Stamm von P. falciparum 3D7 (Pf3D7) wurde vom Department of Science der Monash University, Malaysia, bezogen und wie zuvor beschrieben kultiviert [18]. Der Artemisinin-resistente Stamm von P. falciparum IPC5202 (Pf5202) wurde von BEI Resources bezogen und wie im Produktblatt angegeben kultiviert. Beide Stämme wurden in verschlossenen Kolben bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre aus 5 % O2, 5 % CO2 und 90 % N2 gehalten. Alle Puffer-Stammlösungen für biologische Tests wurden 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert.

Frisches B+-Blut wurde mit RPMI1640-Medium, das 30 µg/ml Gentamicin (Gibco) enthielt, gewaschen und dreimal 10 Minuten lang bei 1000 xg zentrifugiert. Der Prozentsatz der Hämolyse wurde spektroskopisch unter Verwendung einer 5 % Hämatokrit enthaltenden Testverbindung bei steigender Konzentration bestimmt und 72 Stunden lang bei 37 °C inkubiert [19, 20]. Unbehandeltes Blut fungierte als Negativkontrolle, während mit sterilem destilliertem Wasser behandeltes Blut als Positivkontrolle fungierte (für 100 % Hämolyse).

Zuvor berichtete Anti-Malaria-Assays wurden mit geringfügiger Modifikation unter Verwendung von 1 % Parasitämie (Ringstadium) und 5 % Hämatokrit verwendet, mit Testverbindungen in steigender Konzentration behandelt und 72 Stunden lang bei 37 °C inkubiert [21,22,23]. Nach der Inkubation wurde der Assay durch einen Einfrier-/Auftauzyklus (– 80 °C über Nacht, bevor 2 Stunden lang aufgetaut) beendet, bevor Lysepuffer mit dem Farbstoff SYBR Green I in jede Vertiefung gegeben und 30 Minuten lang gründlich mit der Bauchtänzerin gemischt wurde die Dunkelheit. Als Standardmedikamente wurden Chloroquindiphosphatsalz und Artemisinin verwendet. Das Fluoreszenzsignal wurde bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 528 nm quantifiziert. Die IC50-Werte jeder Testverbindung wurden aus einer Dosis-Wirkungs-Kurve durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt.

Ein zuvor beschriebener spektrometrischer Assay unter Verwendung von PNDA wurde verwendet, um die Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu quantifizieren, nämlich. •OH-Radikale, erzeugt durch die Reaktion von Metall(II)-Komplexen mit Wasserstoffperoxid in Boratpuffer bei pH 7,5 [24,25,26]. Der Prozentsatz der PNDA-Bleichung und die Konzentration an erzeugtem •OH wurden bestimmt.

Zur Bestimmung des intrazellulären ROS-Spiegels bei P. falciparum-Parasiten wurde ein zuvor veröffentlichtes Verfahren mit geringfügiger Modifikation verwendet [27]. Kurz gesagt, parasitierte rote Blutkörperchen wurden 24, 48 und 72 Stunden lang bei 37 °C mit Testverbindungen behandelt. Nach der Inkubation wurden die gepackten Zellen mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurde eine PBS-Lösung mit 10 µM DCFH-DA hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert, bevor die Fluoreszenzintensitäten bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm aufgezeichnet wurden. Die Daten wurden als fache Änderung zwischen der Menge an ROS ausgedrückt, die von behandeltem P. falciparum und unbehandeltem P. falciparum produziert wurde. Die Normalisierung erfolgte mit dem Prozentsatz der Lebensfähigkeit des Parasiten, der bei jeder Bedingung erreicht wurde. Als Positivkontrolle wurde Wasserstoffperoxid verwendet.

Um P. falciparum-Parasiten zu ernten, wurden intraerythrozytisches Pf3D7 und Pf5202 im Trophozoiten- und frühen Schizontenstadium gesammelt. Rote Blutkörperchen wurden in 0,15 % (w/v) Saponin-Lysepuffer 10 Minuten lang bei 37 °C lysiert. Nach der Lyse wurde das Parasitenpellet einmal mit PBS-Puffer durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 1600 U/min gewaschen. Saponin-Lysepuffer wurde noch einmal hinzugefügt, um alle roten Blutkörperchen 10 Minuten lang bei 37 °C zu entfernen, gefolgt von zweimaligem Waschen mit PBS und sofort verwendet oder bei –80 °C aufbewahrt. Um Parasitenlysate für die Proteasomreinigung vorzubereiten, wurde das Parasitenpellet mit 100 µl vorgekühltem Pierce™ RIPA-Puffer resuspendiert. Zur Herstellung von Parasitenextrakten wurde eine milde Proteinextraktionsmethode verwendet. Die resuspendierten Parasiten wurden 20 Mal durch eine Nadel mit einem Durchmesser von 0,4 mm in einer Spritze auf Eis geführt, um den Parasiten zu lysieren. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 13.000 xg und 4 °C wurde der Überstand entfernt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bradford-Assay bestimmt [28]. Die Aktivitäten von 3 proteolytischen Stellen wurden durch Fluoreszenzassay unter Verwendung fluorogener Peptidsubstrate (Suc-LLVY-AMC für Chymotrypsin-ähnliche, Boc-LRR-AMC für Trypsin-ähnliche und Suc-LLE-AMC für Caspase-ähnliche) bestimmt [24,25 ,26, 29] Proteasomaktivitäten wurden durch Überwachung der Substrathydrolyse für 30 Minuten bei 37 °C mit 340 nm Anregung und 465 nm Emissionswellenlänge bestimmt. Die Aktivität jeder proteolytischen Stelle wurde berechnet und die IC50-Werte wurden aus der nichtlinearen Regressionsanalyse bestimmt. Als Positivkontrolle wurde der VR23-Proteasom-Inhibitor verwendet.

Das Mitochondrienmembranpotential wurde mit einem BD™ MitoScreen Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection JC-1 Kit untersucht. Kurz gesagt, parasitierte rote Blutkörperchen wurden 12 und 48 Stunden lang bei 37 °C mit Testverbindungen in den gewünschten Konzentrationen behandelt. Nach der Inkubation wurden die gepackten Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt [30]. Die Dissipation in Δψm wurde durch Berechnung des Verhältnisses zwischen roter und grüner Fluoreszenz gemessen.

Der Nachweis hämolytischer und apoptotischer morphologischer Merkmale wurde an mit Giemsa gefärbten dünnen Blutausstrichen untersucht. Der Parasit wurde dann durch Ölimmersion (100-fache Vergrößerung) unter einem aufrechten Hellfeldmikroskop sichtbar gemacht. Ein weiterer dünner Blutausstrich wurde angefertigt, mit Methanol fixiert, in 10 µg/ml Hoechst 33.258-Färbung gefärbt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt [31]. Ein Deckglas wurde angebracht und die nukleare morphologische Untersuchung wurde dann mit Öl bei 100-facher Vergrößerung durch ein Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines DAPI-Filters sichtbar gemacht.

Alle [Cu(phen)2(H2O)](NO3)2 (1), [Zn(phen)2(H2O)2)](NO3)2 (2), [Cu(phen)(NO3)(H2O )]-4,4′-bipy-[Cu(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (3) und [Zn(phen)(NO3)(H2O)-4,4′-bipy- Zn(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (4)-Komplexe enthalten zwei koordinierte Phen-Liganden, wobei ein oder zwei Phen an dasselbe Metallatom koordiniert sind. Alle festen Produkte waren bemerkenswert luftstabil. Die vorgeschlagenen Formeln (1)–(4) werden durch Elementaranalysen gestützt. Über die Kristallstruktur des einkernigen Kupfer(II)-Komplexes (1) mit einem chelatisierten Wassermolekül und zwei Phenliganden sowie einer verzerrten trigonalen Bipyramidengeometrie um das Kupferatom wurde bereits früher berichtet [32]. Die Struktur des Dikupfer(II)-4,4′-bipy-verbrückten Komplexes (3) wird hier beschrieben (Abb. 1). Die Struktur von 3 ähnelt den zuvor beschriebenen [33, 34]. Die Umgebung jedes Kupfer(II)-Atoms in (3) ist ein verzerrtes Oktaeder mit Cu-N1(phen), Cu-N2(phen), Cu-N3(amino-4,4'-bipy), Cu-O1 (OH2), Cu-O6(ONO2) und Cu-O5(ONO2) Bindungsabstände von 2,028, 2,016, 1,986, 2,224, 1,994 und 2,707 Ǻ (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Alle Komplexe (1)–(4) weisen in ihren FTIR-Spektren zwei Peaks im Bereich von 846–856 und 720–725 cm−1 auf, die auf ν(CNC)-Schwingungen des koordinierten Phens zurückzuführen sind [35]. Das Vorhandensein von 4,4′-Bipy in den Komplexen (3) und (4) wird durch zwei Peaks bei 1610 und 1026 cm−1 in ihren FTIR-Spektren angezeigt [36]. Die feste Struktur des Zink(II)-Komplexes (2) ist unbekannt, ist aber höchstwahrscheinlich oktaedrisch, wie die von [Zn(phen)2(H2O)2]L (L = Fumarat) [37]. Die Struktur des Dizink(II)-Komplexes (4) ähnelt möglicherweise der von (3), anders als für Catena-Poly[diaqua(1,10-phenanthrolin-κ2N,N′)zink(II)]-μ-4 beschrieben ,4′-Bipyridin-κ2N,N']-Dinitrat 4,4′-Bipyridin-Hemisolvat-Monohydrat [38]. Darüber hinaus wird das Vorhandensein von Phen- und 4,4'-Bipy-Liganden in den Zn(II)-Komplexen (2) und (4) durch 1H- und 13C-NMR-Spektraldaten bestätigt (Zusatzdatei 1: Abbildungen S1.1 bis S2). .2). Die ChemDraw-Strukturen von (1)–(4) sind in Abb. 2 dargestellt.

ChemDraw-Strukturen von (1)–(4) im Festkörper. Die Strukturen der Kupfer(II)-Komplexe (1) und (3) stammen aus ihren gelösten Kristallstrukturen, während die der Zink(II)-Komplexe (2) und (4) postuliert werden

Strukturell gesehen weisen die zentralen Metallatome dieser Gruppe aus vier Komplexen unterschiedliche Strukturen auf, nämlich trigonale Bipyramide, oktaedrische und quadratische Pyramide. Darüber hinaus weisen auch die Metall(II)-Komplexe (2) und (4) deutliche strukturelle Unterschiede auf: Ersterer ist einkernig, letzterer zweikernig, was sich auf ihre chemischen und biologischen Eigenschaften auswirken könnte. Beispielsweise wurde berichtet, dass der Polymerkettenkomplex [Cu(H2ct)Cl]n (ct, 5α-Ketoglutarsäurethiosemicarbazon) die DNA-Synthese von Krebszellen steigert, während das dimere [Cu(H2ct)Cl]2 die DNA-Synthese verringert [39]. ]. In einem anderen Bericht über eine Reihe von Monomer- und Dimer-Zinkkomplexen von N-Furfuryl-N-substituiertem Benzyldithiocarbamat wurde festgestellt, dass die Monomerspezies stabiler sind als die Dimerspezies und ihre antiproliferative Wirkung deutlich unterschiedlich ist [40].

Alle Komplexe waren in DMSO gut löslich, in Wasser jedoch weniger löslich, und DMSO-Wasser-Lösungen (geringer DMSO-Gehalt) dieser Komplexe waren für verschiedene physikalische, chemische und biologische Studien geeignet. Leitfähigkeitsmessungen und UV-sichtbare Spektroskopie wurden verwendet, um ihre Metallspezies in wässrigen Lösungen und ihre Stabilität aufzuklären. Die Absorption bei λmax der UV-Spektren (30 µM) und der sichtbaren Spektren (5 mM) sowie die Leitfähigkeit (1 mM) der wässrigen Lösung der Metall(II)-Komplexe (1)–(4) und ihrer Vorläufer wurden bei 0 erhalten , 24, 48 und 72 Stunden.

Die Kupfer(II)- und Zink(II)-Nitratsalze sowie die Metall(II)-Komplexe (1) und (2) haben molare Leitfähigkeitswerte von etwa 215–271 S cm2 mol−1 (Zusatzdatei 1: Tabelle S3), die im Bereich typischer 2:1-Elektrolyte liegen [41, 42]. Dies legt nahe, dass jedes Molekül der Metall(II)-bis(phen)-Komplexe (1) und (2) in das kationische [Cu(phen)2]2+ bzw. [Zn(phen)2]2+ dissoziiert ist (bzw existieren als ihre hydratisierten Spezies [Cu(phen)2(H2O)]2+ und [Zn(phen)2(H2O)2]2+) und zwei NO3−-Ionen beim Auflösen in wässriger Lösung. Das Vorhandensein dieser wässrigen kationischen Spezies von (1) und (2) wird durch intensive UV-Spektralpeaks {222, 271 nm für (1); 223, 270 nm für (2)} (Zusatzdatei 1: Tabelle S4), zurückzuführen auf koordiniertes Phen [43]. Der sichtbare Spektralpeak (λmax, 709 nm; ε, 64 mol−1dm3cm−1) von [Cu(phen)2(H2O)]2+ von (1) aufgrund des dd-Übergangs ist charakteristisch für [CuL2]2+ (L = bpy, phen) Arten, die von anderen gefunden wurden [44,45,46]. Das Vorhandensein von zwei koordinierten Phen in den postulierten hydratisierten Spezies von (1) und (2) wird durch ESI-MS-Daten gestützt, die das gasförmige Addukt [M(phen)2(NO3)]+ als Hauptspezies identifizieren (Zusatzdatei 1). : Tabelle S5). Koordinierte Wassermoleküle wässriger Spezies von (1) und (2) können unter ESI-MS-Bedingungen leicht dissoziieren, und es ist bekannt, dass sich das freie gasförmige Nitrat-Anion unter ESI-MS leicht mit freien gasförmigen Metallkationen oder kationischen Metall-Ligand-Spezies verbindet oder von ihnen angezogen wird Bedingungen [47, 48]. Tatsächlich zeigen die ESI-MS-Daten im Negativionenmodus das Vorhandensein eines größeren m/z-Peaks, der den NO3−-Ionen entspricht, was auf das Vorhandensein dieser dissoziierten Anionen hinweist (Daten nicht gezeigt). Die molare Leitfähigkeit und das sichtbare molare Absorptionsvermögen von (1) sowie die molare Leitfähigkeit von (2) bleiben über einen Zeitraum von 24, 48 und 72 Stunden praktisch unverändert, was auf die Stabilität der kationischen Metall(II)-Spezies und keine Änderung ihrer Koordinationssphären schließen lässt .

Darüber hinaus weisen die Dimetall(II)-Komplexe (3) und (4) höhere molare Leitfähigkeitswerte von 350–366 S cm2 mol−1 auf, die zwischen den Werten für 2:1 (145–273 S cm2 mol−1) liegen. und 3:1 (408–435 S cm2 mol−1) Elektrolyte (Zusatzdatei 1: Tabelle S3) [42]. Dies deutet auf zwei Dikupfer(II)-Spezies in der Lösung von (3) hin. In ähnlicher Weise kann das Vorhandensein von koordiniertem 4,4'-Bipy in (3) und (4) durch Vergleich des intensiven UV-Peaks bei 240 nm von freiem 4,4-Bipy (ε, 15.333 mol−1dm3cm−1) mit abgeleitet werden Der verstärkte UV-Peak von (3) bei 230 nm (ε, 65.000 mol−1dm3cm−1) und der von (4) bei 231 nm (ε, 78.333 mol−1dm3cm−1) werden dem koordinierten 4,4 zugeschrieben ′-bipy (Zusatzdatei 1: Tabelle S4). Ähnlich wie bei den einkernigen Komplexen (1) und (2) kann das Vorhandensein von koordiniertem Phen in den zweikernigen Metall(II)-Komplexen (3) und (4) aus ihren intensiven UV-Peaks bei 230 nm und 272 nm für (3) und geschlossen werden diejenigen bei 231 nm und 270 nm für (4). Die ESI-MS-Daten (Zusatzdatei 1: Tabelle S5) von (3) zeigen zwei Peaks bei m/z-Werten von 237,93 (100 %) und 382,18 (31 %), die den Addukten [Cu(phen)- 4,4′-bipy-Cu(phen)(NO3)]3+ bzw. [Cu(phen)(NO3)-4,4′-bipy-Cu(phen)(NO3)]2+. Der berechnete Wert für den 31 %-Peak beträgt 383,23, was [Cu(phen)(NO3)-4,4'-bipy-Cu(phen)(NO3) + H]2+ sein könnte. Wie im vorhergehenden Absatz erwähnt, sind die beiden zweikernigen Metall(II)-Komplexe, nämlich. dimeres [Cu(phen)(NO3)(H2O)-4,4′-bipy-Cu(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (3) und dimeres [Zn(phen)(NO3)( H2O)-4,4′-bipy-Zn(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (4), haben an jedem Metall(II) ein koordiniertes Nitration. Somit dissoziieren die koordinierten Nitrationen in den kationischen Dimetall(II)-Spezies in der wässrigen DMSO-Lösung (9:1 v/v) nur teilweise und können somit ihre ungewöhnlichen molaren Leitfähigkeiten erklären, die zwischen 2:1 und 3 liegen: 1 Elektrolyte.

Die Wirksamkeit der Zytotoxizität gegenüber nicht parasitierten Wirtszellen – roten Blutkörperchen (RBC) – ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da sie üblicherweise zur Bestimmung der Sicherheit eines Arzneimittels verwendet wird. Die Gesundheit der Erythrozyten ist von entscheidender Bedeutung, da sie als Sauerstoffträger von der Lunge zum Körpergewebe dienen und für das Überleben des Menschen wichtig sind [49]. Der Prozentsatz der Hämolyse, der auch als hämolytischer Index (HI) bezeichnet wird, wurde spektroskopisch anhand des freigesetzten Hämoglobinvolumens ermittelt. Die Dosis-Wirkungs-Kurve von (1)–(4) und seinen Vorläufern ist in Abb. 3 dargestellt.

Der Prozentsatz der Hämolyse von (1)–(4) und ihren Vorläufern nach 72-stündiger Inkubation

Die Kupfer(II)-Komplexe (1) und (3) sowie Cu(NO3)2 zeigten eine konzentrationsabhängige Hämolyse mit einem Anstieg der Lyse von Erythrozyten mit zunehmender Konzentration. Bei einer Konzentration von ≤ 0,2 µM hatten Kupfer(II)-Komplexe keine toxische Wirkung auf Erythrozyten. Bei 1 µM wurde keine bis leichte Hämolyse beobachtet, wobei (3) den höchsten HI-Wert (35 %) aufwies, gefolgt vom HI-Wert von (1) und Cu(NO3)2 mit 4–3 %, was auf keine Hämolyse hinweist . Die Hämolyse von (1) und (3) erreicht ihr Maximum bei 5 µM (80 % und 96 %), was nahe an der 50 %igen Hemmung des Parasitenwachstums liegt. Ein ungewöhnliches Ereignis wurde in (1) und (3) beobachtet, wo die HI-Werte von 5 µM auf 25 µM bei 43–36 % sanken. Dies kann auf die schnelle ROS-induzierte Hemmung zurückzuführen sein, die durch (1) und (3) bei hoher Konzentration ausgelöst wird und zur Oxidation von Eisen(II)-Ionen (Fe2+, orangerot) im Hämoglobin zu Eisen(IV)-Ionen führt ( Fe4+, hellviolett) [50]. Dadurch verschlechterte sich die Rötung des Hämoglobins und es konnte bei 570 nm nicht mehr genau gemessen werden. Bei den Liganden und den Zink(II)-Komplexen (2) und (4) wurde bei B+-Blut keine Hämolyse beobachtet, was auf die ungiftige Natur bis zu 25 µM hinweist. Dies bedeutet, dass diese Verbindungen praktisch sicher für die Anwendung am Menschen sind.

Der auf SYBR Green 1 basierende Assay wird üblicherweise zur Bewertung potenzieller Antimalariamedikamente verwendet [21]. Reife Erythrozytenzellen haben keine DNA-haltigen Kerne und SYBR Green ist ein Cyaninfarbstoff, der sehr intensiv fluoresziert, wenn er direkt an die doppelsträngige DNA von P. falciparum gebunden wird, die die reifen Erythrozytenzellen infiziert. Wie aus den IC50-Werten (Tabelle 1) hervorgeht, erwies sich der Stamm Pf3D7 als empfindlich gegenüber Chloroquin (CQ) und Artemisinin (ART), der Stamm Pf5202 war dagegen resistent (IC50 > 100 μM). Der Phen-Ligand hat einen IC50-Wert von 4,27 μM gegenüber Pf3D7, was zeigt, dass es sich um einen bioaktiven Liganden handelt, während dies beim 4,4′-Bipy nicht der Fall ist. Bei allen Metall(II)-Komplexen führt die Metall(II)-Chelatbildung durch Phen hauptsächlich zu einer leichten Verstärkung ihrer Antimalaria-Eigenschaft, mit Ausnahme von (3), wo es zu einer etwa 5-fachen Verstärkung kommt. Das Kupfer(II)-nitrat war sowohl gegenüber den Malariastämmen Pf3D7 (IC50, ~ 46 μM) als auch gegenüber den arzneimittelresistenten Pf5202 (IC50, ~ 49 μM) mäßig aktiv, während das Zink(II)-nitrat gegenüber beiden Stämmen nicht aktiv war. Wie erwartet sind die Kupfer(II)-Komplexe (1) und (3) gegenüber dem arzneimittelempfindlichen Stamm Pf3D7 zytotoxischer als die entsprechenden Zink(II)-Analoga (2) und (4). Dies lässt sich leicht anhand der nachgewiesenen Eigenschaft von Kupfer(II)-Komplexen verstehen, dass sie ROS-Stress induzieren, das Wachstum hemmen und den Zelltod auslösen können [51, 52]. Wie jedoch später zu sehen ist, verursachen die oben genannten Zink(II)-Komplexe in hoher Konzentration keine Hämolyse der Erythrozyten, sind aber etwa gleich wirksam gegen den arzneimittelempfindlichen Malariastamm Pf3D7.

Der einkernige Kupfer(II)-Komplex [Cu(phen)2(H2O)](NO3)2 (1) war gegenüber Pf3D7 etwas wirksamer als Phen, seine Wirksamkeit gegenüber dem arzneimittelresistenten Malariastamm Pf5202 war jedoch um das Dreifache reduziert, d nur wenig medikamentenresistent. Der Dikupfer(II)-Komplex (3) mit einem IC50-Wert von 0,9 μM war viel wirksamer als Phen (IC50 4,27 μM) gegenüber Pf3D7 (um das 4,7-fache) und war immer noch wirksam gegen Pf5202 (IC50, 2,2 μM), was darauf hindeutet sein potenzieller Einsatz gegen arzneimittelresistente Malaria. Andererseits war der Dizink(II)-Komplex (4) wirksam gegenüber dem arzneimittelempfindlichen Pf3D7 (IC50, 3,9 μM), stieß jedoch beim Artemisinin-resistenten Malariastamm Pf5202 (IC50 > 100 μM) auf eine vollständige Arzneimittelresistenz. Aus der obigen Analyse geht hervor, dass (3) sehr vielversprechend ist und ein gutes Potenzial gegen arzneimittelresistente Malaria hat, wenn wir sehen, dass beide klinischen Medikamente, Chloroquin und Artemisinin, einen massiven Rückgang der Wirksamkeit um mehr als das 3000-fache verzeichneten, und das war bei Pf5202 der Fall völlig resistent gegen diese beiden Medikamente. Im Vergleich dazu zeigte ein anderer vielversprechender Chemotyp, eine „Halbsandwich“-Cyclopentadienylruthenium(II)-Leitverbindung Ru2, eine schnelle parasitizide Aktivität sowohl gegen Ring- als auch Trophozoitenstadien eines synchronisierten Pf3D7-Stamms und war hochwirksam gegen Pf5202-resistenten Stamm (IC50, 0,068 μM). ) [7]. Überraschenderweise war der wirksamste Fe(III)-mehrzähnige Ligandenkomplex wirksamer gegenüber verschiedenen resistenten Malariastämmen (IC50, 30–50 μM) als gegenüber dem Chloroquin-empfindlichen Stamm Pf3D7 (IC50, 90 μM) [53]. In unserem Fall war der Kupfer(II)-Komplex (3) umgekehrt, dh wirksamer gegenüber dem empfindlichen Stamm Pf3D7 als Pf5202.

Ein Wirkungsmechanismus von Malariamitteln ist die Induktion von ROS und daraus resultierendem oxidativem Stress, um den Malariaparasiten abzutöten. Um dies zu untersuchen, wurde eine relevante Modellreaktion unter Verwendung von PNDA als Überwachungsmittel [24,25,26] und ein intrazellulärer DCFH-DA-Assay verwendet [27].

Mittlerweile ist es allgemein anerkannt, dass zahlreiche Antimalariamittel zum Tod durch Malaria führen, indem sie ROS und oxidativen Stress induzieren [54, 55]. Daher ist es wichtig, die Menge der erzeugten ROS, insbesondere der schädlicheren Hydroxylradikale, quantifizieren und vergleichen zu können. Für redoxaktive Metallkomplexe ist der PNDA-Assay am besten geeignet, da Wasserstoffperoxid in menschlichen Zellen und Malariaparasiten allgegenwärtig ist [56, 57]. Die Menge an ·OH-Radikalen, die durch die Reaktion der äquimolaren Menge an Testverbindungen mit überschüssigem H2O2 entsteht, ist direkt proportional zum Bleichen des PNDA (Abb. 4) im Molverhältnis 1:1 und der Konzentration von ·OH Die erzeugten Radikale sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Zink(II)-Komplexe (2) und (4) sowie die Ausgangsmaterialien, d. h. Phen, 4,4′-Bipy und Zinknitrat erzeugten keine ·OH-Radikale. Alle Kupfer(II)-Verbindungen, d.h. Cu(NO3)2, (1) und (3), erzeugte ·OH-Radikale, die von 2 auf 4 Stunden anstiegen und nach etwa 24 Stunden ein Maximum erreichten. Insgesamt erzeugte einkerniges (1) eine größere Menge an ·OH-Radikalen als zweikerniges (3). Es wurde angenommen, dass (3) weniger ·OH-Radikale als Cu(NO3)2 erzeugte und (1) aufgrund der sterischen Hinderung aufgrund seiner sperrigen Struktur mit der Formel [Cu(phen)-4,4′-bipy-Cu (phen)]4+ in der Lösung. Zweikernig (3) könnte Schwierigkeiten haben, ein Cu(II)-Hydroperoxid-Zwischenprodukt zu bilden, da jedes Cu(II)-Ion als koordinativ gesättigt angesehen wurde, insbesondere wenn die labilen Wassermoleküle und Nitrationen koordiniert blieben. Obwohl der einkernige Kupfer(II)-Komplex (1) bei der Erzeugung von ·OH-Radikalen besser ist als der zweikernige Kupfer(II)-Komplex (3), ist ersterer mit einem IC50-Wert von etwa 4 × weniger toxisch für den Malariaparasiten als letzterer größer. Dies deutet auf die Beteiligung anderer Wirkmechanismen hin, wie auch von anderen hervorgehoben wurde [51].

Auftragung der prozentualen PNDA-Bleichung von Reaktionsmischungen, bestehend aus 42 µM PNDA, 60 mM H2O2 und 30 µM (1)–(4) und seinen Vorläufern in Boratpuffer bei pH 7,5, gegen die Zeit in Stunden

Die mit Malaria infizierten Erythrozytenzellen wurden mit zunehmender Konzentration jedes Metall(II)-Komplexes (1)–(4), Phen oder H2O2 24, 48 und 72 Stunden lang inkubiert. Die Ergebnisse für mit Pf3D7 infizierte RBC-Zellen (Tabelle 3 und Abb. 5) zeigen, dass eine 48-stündige Inkubation am besten geeignet war, da die Anzahl der ROS-Anstiege am höchsten war. Wie die Ergebnisse des PNDA-Tests erwies sich der einkernige Kupfer(II)-Komplex [Cu(phen)2(H2O)](NO3)2 (1) als besserer Generator intrazellulärer ROS als der zweikernige [Cu(phen)(NO3) (H2O)]-4,4'-bipy-[Cu(phen)(NO3)(H2O)](NO3)2 (3). Allerdings ist (1) gegen den Malariastamm Pf3D7 weniger wirksam als (3) (IC50-Werte in Tabelle 1). Daher kann die höhere Anti-Malaria-Wirksamkeit von (3) nicht allein auf diese in Erythrozytenzellen induzierten ROS zurückzuführen sein, und andere Wirkmechanismen sind impliziert, wie im vorherigen Abschnitt angedeutet [51].

Die Faltungsänderungen der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die durch Phen, H2O2 und (1)–(4) auf Pf3D7 induziert werden. Blau (24 Std.). Orange (48 Std.). Grau (72 Std.)

Was die Pf5202-infizierten Erythrozytenzellen betrifft, die mit zunehmender Konzentration an Metallkomplexen behandelt wurden, betrug die beste Inkubationsdauer für die Behandlung Pf5202-infizierter Erythrozytenzellen immer noch 48 Stunden (Tabelle 4 und Abb. 6). Unter den vier Komplexen sind die beiden Zink(II)-Komplexe, nämlich. (2) und (4) schienen keine ROS zu erzeugen, da die fache Steigerung der ROS negativ war. Andererseits sind die beiden Kupfer(II)-Komplexe, nämlich. (1) und (3) induzierten mit zunehmender Konzentration der Komplexe eine zunehmende Faltungsänderung der ROS. Im Gegensatz zu den Ergebnissen für Pf3D7 war der Dikupfer(II)-Komplex (3) ein besserer Generator intrazellulärer ROS als (1) im arzneimittelresistenten Malariastamm Pf5202, und dies könnte mit seiner hohen Wirksamkeit gegenüber dem Stamm Pf5202 korrelieren. Dies deutet darauf hin, dass Dikupfer(II)-Komplexe ein größeres Potenzial zur Bekämpfung arzneimittelresistenter Malariastämme haben. Eine weitere detaillierte Untersuchung des Mechanismus der ROS-induzierten Wirkungsweise von (3) ist geplant und könnte die gezielte Bekämpfung und Schädigung der redoxbezogenen Proteine ​​und damit die Störung der Redoxhomöostase und -prozesse beinhalten, wie dies bei der Erzeugung von Alkylradikalen der Fall war Peroxid-Anti-Malaria-Medikamente wie Artemisinin [58]. Aufgrund einer aktuellen Erkenntnis werden auch (1) und (3) als ROS-Induktoren getestet, um zu sehen, ob sie die Wirksamkeit peroxidhaltiger Malariamittel wie Artemisinin durch direkte Oxidation von Oxyhämoglobin zu Methämoglobin erhöhen könnten dann zu Eisen(III)-haltigen Hemichromen, die dann die Peroxideinheit aktivieren, um kohlenstoffzentrierte Radikale zu erzeugen, die den Tod der erythrozytären Malaria auslösen [59]. Diese beiden Kupfer(II)-Komplexe ähneln möglicherweise auch Metalloporphyrinen, von denen kürzlich festgestellt wurde, dass sie die Antimalaria-Eigenschaft von Artemisinin und synthetischen Endoperoxid-Antimalariamedikamenten verstärken [60]. Zusätzlich zum oxidativen Stress als Wirkmechanismus in diesem Abschnitt werden in den nächsten beiden Abschnitten die Hemmung des Proteasoms und die gezielte Bekämpfung der Malaria-Mitochondrien vorgestellt.

Die Faltungsänderungen der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die durch Phen, H2O2 und (1)–(4) auf Pf5202 induziert werden. Blau (24 Std.). Orange (48 Std.). Grau (72 Std.)

Es besteht zunehmende Besorgnis über das Auftreten und die Verbreitung arzneimittelresistenter Malariastämme, und es werden viele Ansätze zur Überwindung der Arzneimittelresistenz entwickelt. Tatsächlich tauchen immer mehr Ergebnisse auf, die das Potenzial der Entwicklung wirksamer parasitenspezifischer Arzneimittel durch gezielte Bekämpfung des Malaria-Proteasoms auf der Grundlage der deutlichen Unterschiede zwischen Malariaparasiten und dem menschlichen Wirt zeigen [61]. Kürzlich wurde festgestellt, dass ein Tripeptid-Vinylsulfon, das selektiv die TL-Stelle des 20S-Proteasoms von P. falciparum hemmt, das Parasitenwachstum in vivo abschwächen kann, ohne den Wirt nennenswert zu schädigen [62]. Der Grund dafür, dass der Wirt nicht geschädigt wurde, wurde auf eine schlechte Hemmung der CT-L-Stelle des menschlichen 20S-Proteasoms zurückgeführt. In einem anderen Bericht hemmte ein Proteasom-Inhibitor Lactacystin die Entwicklung der exoerythrozytischen und erythrozytischen Stadien des Malariaparasiten [63]. Daher untersucht dieser Abschnitt die Hemmung der drei proteolytischen Stellen des 20S-Proteasoms der Pf3D7- und Pf5202-Lysate im Vergleich zu einem bekannten TL-stellenselektiven Inhibitor (VR23). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Abb. 7 dargestellt.

IC50 von Phen und (1)–(4) am 20S-Proteasom an der Trypsin-ähnlichen (TL) Stelle nach 30-minütiger Inkubation mit dem jeweiligen Substrat im CO2-Inkubator. *bedeutet > 25 µM

Wie erwartet hemmte VR23 selektiv die proteolytische TL-Stelle sowohl in den Malariastämmen Pf3D7 als auch Pf5202. Interessanterweise sind die IC50-Werte von VR23 für beide Malariastämme praktisch gleich. Der freie Phen-Ligand hemmte auch selektiv die TL beider Parasitenstämme. Interessanterweise hemmt Phen die TL-Stelle des arzneimittelresistenten Pf5202-Stammes fast 2,5-mal besser als die von Pf3D7. Die beiden Zink(II)-Komplexe (2) und (4) hemmten alle drei proteolytischen Stellen des Proteasoms nur schwach. Allerdings hemmten die beiden Kupfer(II)-Komplexe (1) und (3) die TL-Stelle von Pf3D7 selektiver als die beiden anderen Stellen (d. h. CL und CL), wobei beide ähnliche IC50-Werte von etwa 2,5 μM aufwiesen. Obwohl sich diese Komplexe gegenüber dem arzneimittelresistenten Pf5202-Stamm gleich verhalten, wurden ihre IC50-Werte etwa 1,5-fach niedriger, was zeigt, dass sie die TL-Stelle dieses Stamms besser hemmen als die des arzneimittelempfindlichen Pf3D7-Stamms. Dies ist von Vorteil, da Malariaparasiten durch eine solche selektive Hemmung der TL-Stelle geschädigt werden können und möglicherweise die Arzneimittelresistenz bei Malaria überwinden können. Beim Vergleich der Ergebnisse des In-vitro-Anti-Malaria-Tests für Pf5202 ist (3) (IC50, 2,2 μM) wirksamer als das von (1) (IC50, 17,8 μM). Dies legt nahe, dass die Anti-Malaria-Eigenschaft der Kupfer(II)-Komplexe gegenüber Pf5202 nicht weitgehend von der selektiven Hemmung der TL-Stelle abhängt. Eine weitere verblüffende Beobachtung ist, dass die Komplexe (1), (3) und Phen eine signifikante Steigerung der Effizienz bei der Hemmung der TL-Stelle von Pf5202 im Vergleich zu der von Pf3D7 zeigen (um den Faktor 1,5x–2,5x), jedoch auf unterschiedliche Wirkstoffgrade stoßen -Resistenz bei Pf5202 (durch höhere IC50-Werte im Anti-Malaria-Assay für Pf5202 als für Pf3D7 (um den Faktor 3–20). Die zusätzliche Empfindlichkeit des arzneimittelresistenten Pf5202-Stamms gegenüber (1), (3) und Phen im Vergleich gegen das arzneimittelempfindliche Pf3D7 ist das erste Beispiel für bekannte Anti-Malaria-Metallarzneimittel. Die zusätzliche Empfindlichkeit des arzneimittelresistenten Pf5202 gegenüber dem selektiven TL-Inhibitor ist unbekannt, sein Ursprung könnte jedoch einem mutierten Malariastamm ähneln, der gegen einen CT-selektiven resistent war Inhibitor und wies eine Punktmutation in der nichtkatalytischen β6-Proteasom-Untereinheit auf [64]. Diese aktuelle Studie zum Malaria-spezifischen CT-Inhibitor Asparaginethylendiamin zeigt, dass die CT-Hemmung nicht optimal ist und eine gleichzeitige Hemmung der TL-Aktivität (d. h. der β5-Stelle) erfordert ) [64].

Einer der Wirkmechanismen einiger Malariamedikamente, wie etwa der Artemisinine, ist die Depolarisation der Mitochondrienmembran, die dann die Apoptose des Parasiten auslöst [65,66,67]. Der JC-1-Membranpotentialtest wurde verwendet, um das mitochondriale Membranpotential (Δψm) von Pf3D7 und Pf5202 zu bewerten, die 12 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen (1, 5, 25 μM) der Kupfer(II)-Komplexe (1) und (3) behandelt wurden 48 Stunden [68] und die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. Unbehandelter gesunder Malariaparasit weist ein hohes Δψm auf. Im Allgemeinen verursachten beide Kupfer(II)-Komplexe eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials bei beiden Malariastämmen mit zunehmender Konzentration der Komplexe für beide Inkubationsperioden. Bei 1 μM induzierten sowohl (1) als auch (3) einen signifikanten Abfall von Δψm sowohl für die Pf3D7- als auch für die Pf5202-Stämme, was auf den Kollaps der Mitochondrienmembran schließen lässt. Daher ist die Depolarisierung des Malaria-Mitochondrienmembranpotentials ein beitragender Wirkungsmechanismus beider Kupfer(II)-Komplexe und wird allgemein als Teil des Ereignisses angesehen, das zum apoptotischen Tod der Malaria führt.

Das endgültige Programm zum Zelltod bei P. falciparum, der im Gegensatz zu menschlichen Zellen durch Malariamedikamente ausgelöst wird, ist noch nicht schlüssig [69]. Es ist auch bekannt, dass Plasmodium falciparum in roten Blutkörperchen, die mit Medikamenten wie Chloroquin behandelt werden, zu einem autophagischen Tod ohne Chromatinkondensation (Apoptose) oder Schwellung und Zerstörung der Plasmamembran (Nekrose) führt [70]. Obwohl es P. falciparum an klassischen Caspasen mangelt, wurde berichtet, dass es Meta-Caspasen produzieren kann, die den programmierten Zelltod auslösen [71]. Um eine vorläufige Untersuchung der Art des Zelltods der mit den Kupfer(II)-Komplexen (1) und (3) behandelten P. falciparum-Stämme durchzuführen, wurden Giemsa- und Hoechst-Färbungen verwendet, um morphologische Veränderungen der behandelten parasitären Zellen zu untersuchen das infizierte Erythrozyten.

Giemsa-Farbstoff, eine Mischung aus Azurblau, Methylenblau und Eosin, ist ein häufig verwendeter Nukleinsäurefarbstoff, der menschliche Erythrozyten und Malariaparasiten unterscheidet [72]. Es färbt menschliches Erythrozyten, Malaria-Zytoplasma und Malaria-Kern (Chromatin) rosa-grau, violett-blau bzw. violett-rot. Pf3D7- und Pf5202-infizierte Erythrozytenzellen wurden über einen Zeitraum von 72 Stunden mit steigenden Konzentrationen (0,2, 1, 5 und 25 µM) der Kupfer(II)-Komplexe (1) und (3) behandelt. Bilder von unbehandelten, nicht parasitierten Erythrozyten (nRBC) und parasitierten Erythrozyten (pRBC) sowie behandelten infizierten Erythrozyten wurden unter Verwendung eines aufrechten Hellfeldmikroskops bei Ölimmersion mit 100-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Ergebnisse sind in Abb. 8 dargestellt.

Morphologische Untersuchung von Pf3D7 und Pf5202 an einem Giemsa-gefärbten Abstrich nach 72-stündiger Behandlung mit zunehmender Konzentration von (1) und (3) bei 100-facher Vergrößerung (Ölimmersion). Blauer Pfeil: Schizonten gebrochen; grüner Pfeil: verzerrte und geschrumpfte pyknotische Form; Oranger Pfeil: Hämolyse

Unbehandelte nRBC waren rosa-grau gefärbt und es wurde kein P. falciparum beobachtet. Unbehandelte nRBC schienen gesunde und abgerundete Zellen zu sein. Eine ähnliche Beobachtung wurde bei unbehandelten pRBC beobachtet, bei denen alle unbehandelten pRBC als gesunde und abgerundete Zellen zurückblieben und die Morphologie von Pf3D7 und Pf5202 in einem guten Zustand war und eine viel größere Parasitämie aufwies. Die Mehrheit (~ 90 %) des unbehandelten Pf3D7 und Pf5202 lag in der Trophozoiten- und Schizontenform vor und bestand aus kleinen Doppelchromatin-Punkt-“Kopfhörer“-Ringen. Nach der Behandlung mit (1) oder (3) gegen pRBC wurden mehrere morphologische Beobachtungen beobachtet. Zu den häufigsten Anomalien der Erythrozyten gehören Hämolyse, Membranverformung und eine Abnahme der Erythrozytendichte. Bezüglich der Morphologie von Pf3D7 und Pf5202 wurden eine Abnahme der Parasitämie, eine Verformung der Parasitenmembran, eine Schrumpfung des Parasiten, ein Bruch des Schizonten und die Bildung einer pyknotischen (nicht lebensfähigen) Form festgestellt. Alle diese Anomalien sind die Merkmale des apoptotisch programmierten Zelltods von Erythrozyten und P. falciparum [73]. Ähnliche Beobachtungen wurden von zahlreichen Forschern berichtet, als P. falciparum mit Chloroquin, Atovaquon, synthetischem Fluoreszenzpeptid, Peptid-Morpholinooligomer, Endoperoxidverbindungen, Zn(II)-Dipicolylamin-Komplexen oder Dihydroartemisinin behandelt wurde [74,75,76,77,78, 79].

Wenn Pf3D7-infizierte Erythrozyten mit (1) (IC50 = 3,51 µM) behandelt wurden, blieben pRBC bei 0,2 µM und 1 µM in gesundem Zustand, wobei P. falciparum hauptsächlich als Trophozoiten und Schizonten auftrat. Zwischen 1 µM und 25 µM begann sich pRBC zu verformen und aufzubrechen, was zur Hämolyse führte. Die Lyse von Erythrozyten wiederum reduzierte indirekt die Parasitämie von Pf3D7 aufgrund des Mangels an zugeführten Nährstoffen. Zu diesem Zeitpunkt erfuhr Pf3D7 eine Pyknose und die Membran der Parasiten war deformiert, geschrumpft und gebrochen, wie in Bildern von pRBC gezeigt, die mit 5 µM und 25 µM behandelt wurden. Ähnliche Beobachtungen wurden beobachtet, als Pf5202-infizierte Erythrozyten mit (1) behandelt wurden (IC50 = 17,87 µM). Bei 0,2 µM und 1 µM erschien Pf5202 als gesunde Schizonten. Wenn pRBC-Zellen mit Konzentrationen von mehr als 1 µM behandelt wurden, wurden eine Verformung der pRBC-Membran, Hämolyse, eine Abnahme der Parasitämie, die Bildung pyknotischer Parasiten, eine Schrumpfung und ein Aufbrechen der Schizonten beobachtet.

Die morphologischen Merkmale der Apoptose von P. falciparum können durch Chromosomenkondensation und Fragmentierung der P. falciparum-Kerne in den nichtnukleären Erythrozytenzellen angezeigt werden (73, 80). Die kondensierten Chromosomen wären leuchtend blau gefärbt. Die pRBC-Zellen wurden 72 Stunden lang mit (1) bzw. (3) behandelt und die resultierenden pRBC wurden sichtbar gemacht und bei 100-facher Vergrößerung unter Eintauchen in Öl fotografiert. Typische Bilder wurden vergrößert, um einzelne Zellen zu betrachten und sind in Abb. 9 für Pf3D7 und Abb. 10 für Pf5202 dargestellt. Nach 72-stündiger Inkubation befanden sich P. falciparum im reifen Trophozoitenstadium. Die Kerne von P. falciparum-Trophozoiten in pRBC wurden unter dem Hellfeldmikroskop als Punkte beobachtet und waren heller blau gefärbt, deren Fluoreszenzintensität mit zunehmender Konzentration der Kupfer(II)-Komplexe von (1) und (3) von 0,2, 1 zunahm. 5 bis 25 µM im Vergleich zum unbehandelten pRBC. Da die Hoechst-Färbung spezifisch für den Chromatinzustand und die DNA-Konformation ist, lässt die zunehmend stärkere beobachtete Fluoreszenzintensität auf eine stärkere Verformung und Kondensation von Chromatin und DNA schließen [81].

Kernmorphologische Beobachtung von Pf3D7 mittels Hoechst-Färbung nach 72-stündiger Behandlung mit zunehmender Konzentration von (1) und (3) bei 100-facher Vergrößerung (Ölimmersion).

Kernmorphologische Beobachtung von Pf5202 mittels Hoechst-Färbung nach 72-stündiger Behandlung mit zunehmender Konzentration von (1) und (3) bei 100-facher Vergrößerung (Ölimmersion).

Wenn Pf3D7-infizierte RBC-Zellen mit (1) und (3) behandelt wurden, wurde bei der Behandlung mit 1 µM oder mehr des Dikupferkomplexes (3) eine hellere Fluoreszenz beobachtet als bei der Behandlung mit (1). Dies legt nahe, dass dieser Kupferkomplex (3) (IC50, 0,90 µM) eine stärkere Chromatinkondensation induzierte als (1). Das Auftreten einer Chromatinkondensation weist direkt auf die Auslösung eines apoptotischen Phänomens hin. Somit erfuhr Pf3D7 bei Behandlung mit (1) und (3) eine Apoptose. Darüber hinaus wurden verzerrte Parasiten, pyknotische Formen und Brüche von Schizonten bei 5 µM und 25 µM für (1) und ab 1 µM für (3) beobachtet. Ähnliche Phänomene wurden beobachtet, als Pf5202 mit (1) und (3) behandelt wurde. Der Dikupferkomplex (3) (IC50, 2,21 µM) hatte ab 5 µM eine stärkere Fluoreszenzintensität als der einkernige Kupferkomplex (1). Diese stärkere Fluoreszenz könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass (3) jeweils ein zweikerniger Kupfer(II)-Komplex ist, der aus zwei Kupfer(II)-Ionen besteht, und es war möglich, dass es zu einer doppelten oder schnelleren Erzeugung von ROS kam, was zu mehr P führte. Falciparum-Zellen mit stärkerer Chromatinkondensation. Darüber hinaus wurden bei 5 µM und 25 µM verzerrte Parasiten, pyknotische Formen und gebrochene Schizonten festgestellt. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die getesteten Kupfer(II)-Komplexe die Apoptose von P. falciparum induzieren könnten.

Kupfer(II)-Komplexe zeigten eine Anti-Malaria-Wirkung sowohl gegen Pf3D7 als auch gegen Pf5202 im submikromolaren bis mikromolaren Bereich. Die Zink(II)-Komplexe waren gegen Pf3D7 mit ausgezeichnetem therapeutischen Index wirksam, stießen jedoch auf völlige Resistenz gegen Pf5202. Von den vier war der zweikernige Kupfer(II)-Komplex gegen beide Stämme am wirksamsten. Die Zink(II)-Komplexe verursachten keine Hämolyse der Erythrozyten, während Kupfer(II)-Komplexe mit zunehmender Konzentration eine verstärkte Hämolyse induzierten. Weitere mechanistische Studien beider Kupfer(II)-Komplexe an Pf3D7- und Pf5202-Stämmen zeigten die Induktion von ROS, die Hemmung des 20S-Malaria-Proteasoms, den Verlust des Mitochondrienmembranpotentials und morphologische Merkmale, die auf Apoptose hinweisen. Das zweikernige [Cu(phen)-4,4′-bipy-Cu(phen)](NO3)4 ist hochwirksam und kann die gesamte Arzneimittelresistenz von Pf5202 gegenüber Chloroquin und Artemisinin überwinden. Die anderen drei Kupfer(II)- und Zink(II)-Komplexe waren nur gegenüber dem arzneimittelempfindlichen Pf3D7 wirksam, wobei letzteres keine Hämolyse der Erythrozyten verursachte.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Mitochondriales Membranpotential

4,4′-Bipyridin

Artemisinin-Kombinationstherapien

Artemisinin

Chloroquindiphosphatsalz

Kupfer(II)-nitrat-Trihydrat

Hemmkonzentration bei 50 % Wachstumshemmung

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Diese Forschung wurde finanziert durch (i) Universiti Malaya Frontier Research Grant (FRG), Fördernummer: FG036-15AFR; (ii) International Medical University Research Grant, Fördernummer: BMS I/2019(17) und (iii) Fundamental Research Grant Scheme (FRGS), Fördernummer FRGS/1/2019/SKK12/IMU/03/1.

Fachbereich Chemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universiti Malaya, 50603, Kuala Lumpur, Malaysia

Jing Wei Lai, Mohd Jamil Maah, Kong Wai Tan und Rozie Sarip

Abteilung für Parasitologie, Medizinische Fakultät, Universität Malaya, 50603, Kuala Lumpur, Malaysia

Yvonne Ai Lian Lim

Shiv Nadar University, Greater Noida, Indien

Rakesh Ganguly

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, School of Medicine, International Medical University, 57000, Kuala Lumpur, Malaysia

Loke Tim Village

Abteilung für Pharmazeutische Chemie, School of Pharmacy, International Medical University, 57000, Kuala Lumpur, Malaysia

Chew Hee Ng

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JWL führte alle Experimente (mit Ausnahme der Röntgenkristallstruktur und ESI-MS) und Analysen durch. MJM, RS (unterstützte auch bei der NMR-Analyse) und YALL sorgten für die Betreuung und Manuskriptprüfung. RG und KWT haben die Röntgenkristallstruktur von (3) durchgeführt und gelöst. LTK betreute die Parasitenkulturen und fungierte als B+-Blutspender. CHN ist an der experimentellen Gestaltung, dem Verfassen von Manuskripten, der Überwachung und der Überprüfung beteiligt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Chew Hee Ng.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Kristallographische Daten für Kupfer(II)-Komplex (3). Tabelle S2. Ausgewählte Bindungsabstände und Bindungswinkel für den Kupfer(II)-Komplex (3).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lai, JW, Maah, MJ, Tan, KW et al. Zweikernige und einkernige Metall(II)-Polypyridylkomplexe gegen arzneimittelempfindliches und arzneimittelresistentes Plasmodium falciparum und ihre Wirkungsweise. Malar J 21, 386 (2022). https://doi.org/10.1186/s12936-022-04406-0

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Eingegangen: 15. Juli 2022

Angenommen: 28. November 2022

Veröffentlicht: 17. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-022-04406-0

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