Biosynthese, Charakterisierung und anthelmintische Aktivität von Silbernanopartikeln des Clerodendrum infortunatum-Isolats

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Mar 29, 2024

Biosynthese, Charakterisierung und anthelmintische Aktivität von Silbernanopartikeln des Clerodendrum infortunatum-Isolats

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7415 (2023) Diesen Artikel zitieren 893 Zugriffe 1 Zitate 2 Altmetrische Metrikdetails In den letzten Jahrzehnten hat die grüne Synthese von Nanopartikeln zugenommen

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In den letzten Jahrzehnten hat die grüne Synthese von Nanopartikeln aufgrund ihrer therapeutischen Wirksamkeit und Umweltfreundlichkeit an Bedeutung gewonnen. Die Integration der Prinzipien der grünen Chemie in die multidisziplinäre nanowissenschaftliche Forschung hat den Weg für die Entwicklung umweltfreundlicher und nachhaltiger Methoden zur Synthese von Gold- und Silbernanopartikeln geebnet. In der vorliegenden Studie wurden die Blüten von Clerodendrum infortunatum (L.), das zur Familie der Verbenaceae gehört, zur Biosynthese von Silbernanopartikeln (AgNPs) verwendet, um das anthelmintische Potenzial zu bewerten. UV-Vis-Spektroskopie, XRD-, FTIR-, SEM- und TEM-Analysen wurden durchgeführt, um die Bildung von AgNPs festzustellen. Aus Clerodendrum gewonnenes AgNP (CLE-AgNP) hat die normalen physiologischen Funktionen des Geflügelparasiten Raillietina spp., einer Bedrohung für die Viehwirtschaft, erheblich beeinträchtigt. Unsere Studie zeigt, dass CLE-AgNPs eine erhebliche Verformung des Oberflächenteguments dieses Cestodenparasiten verursachen, was zu Veränderungen in der Wirt-Parasit-Schnittstelle führt. Die histochemischen Lokalisierungsstudien der tegumentassoziierten Enzyme, nämlich. AcPase, AlkPase, ATPase und 5'-Nu, die dem Medikament ausgesetzt waren, zeigten einen erheblichen Aktivitätsabfall, was das anthelmintische Potenzial der CLE-AgNPs belegt.

Aktuelle Trends im Tierschutz fördern die Einführung biologischer, stallfreier und Hinterhofhaltungspraktiken. Lokales Hühnerfleisch, das im Rahmen der Hinterhofgeflügelproduktion gezüchtet wird, ist für die Einkommenssicherung kleiner Gesellschaften von entscheidender Bedeutung. Das Wachstum dieses Sektors wird jedoch durch das Wiederauftreten einer vielfältigen Vielfalt an Geflügelwürmern stark behindert. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass Hühner und Truthähne als Wirte für eine Vielzahl von Helminthen dienen, was in tropischen Ländern wie Indien zu enormen wirtschaftlichen Verlusten führt. Der Zestodenparasit Raillietina spp. ist bei gewöhnlichem Hausgeflügel (Gallus gallus Domesticus) weit verbreitet und verursacht Enteritis und Gewichtsverlust bei jungen Hühnern1,2. Zu den gängigen Strategien zur Parasitenbekämpfung gehört die Verwendung der Benzimidazol-Verbindungsklasse wie Flubendazol, Fenbendazol und Albendazol, deren unregulierte Verwendung zu einer Resistenz gegen Helminthen führen kann3. Obwohl die Ethnoveterinärmedizin eine gut etablierte Praxis ist, gibt es nur begrenzte Erkenntnisse zur Pharmakologie pflanzlicher Anthelminthika zur Anwendung bei Hühnern. Die aktuelle Untersuchung wurde durchgeführt, um den therapeutischen Einsatz von Clerodendrum infortunatum (CLE) für die Biosynthese von AgNP als Anthelminthikum gegen die Vogel-Cestode Raillietina spp. zu unterstützen.

Bioinspirierte Technologien zur Synthese von Nanopartikeln (NP) haben sich zu einem wichtigen Zweig der Nanowissenschaften und Nanotechnologie entwickelt. Bisher wurden zahlreiche Metall-NPs und Metalloxide mithilfe von Pflanzenextrakten, Mikroben usw. synthetisiert4,5. Aufgrund ihrer breiten Verfügbarkeit, Erneuerbarkeit und Umweltfreundlichkeit sowie ihrer immensen Anwendungsmöglichkeiten bei der Synthese von NPs wird pflanzliche Biomasse hauptsächlich als Katalysator für die chemische Synthese und die Biodieselproduktion eingesetzt6,7. Es ist seit langem bekannt, dass Silberprodukte starke hemmende und bakterizide Wirkungen sowie ein breites Spektrum an antimikrobiellen Aktivitäten haben und seit Jahrhunderten zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Krankheiten, insbesondere Infektionen, eingesetzt werden8. Aktuelle Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Silbernanopartikel (AgNPs) in verschiedenen medizinischen Anwendungen eingesetzt werden können, darunter antibakterielle, antimykotische, antidiabetische, entzündungshemmende und Krebsbehandlungen sowie in der Diagnose9,10,11,12. Die Synthese von Silbernanopartikeln auf physikalischen und chemischen Wegen wirft schwerwiegende Probleme auf, wie z. B. hohe Kapitalinvestitionen, die Verwendung gefährlicher Chemikalien, hohe Temperaturen und Drücke sowie giftige Lösungsmittel13,14,15. Im Vergleich zu Mikroorganismen ist die Verwendung von Pflanzenextrakten zur Synthese von AgNPs hinsichtlich der Ressourcenverfügbarkeit, Sicherheit, Reaktionsgeschwindigkeit und Bequemlichkeit sowie der Durchführbarkeit einer Synthese im großen Maßstab vorteilhafter16,17,18. Es wurde berichtet, dass die in Pflanzenextrakten enthaltenen sekundären Pflanzenstoffe die Reduktion von Metallionen zu Nanopartikeln bewirken und schließlich den Einsatz toxischer Chemikalien, hohen Druck, hohe Temperatur, Energie und die Aufrechterhaltung mikrobieller Kulturen überflüssig machen19,20,21,22,23,24. Verschiedene Pflanzenmaterialien wie Blattextrakte, Früchte, Rinde, Fruchtschalen, Wurzeln und Kallus wurden untersucht, um NPs in verschiedenen Größen und Formen zu synthetisieren25. Tripathi et al. untersuchten die bakterizide Aktivität von Silbernanokugeln bei einer Konzentration von 40 μg/ml gegen Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa durch Messung koloniebildender Einheiten26. In einer früheren Studie haben Kar et al. untersuchten die in vitro anthelmintische Aktivität der Nanogoldpartikel, die durch myzelfreies Kulturfiltrat des mit Goldchlorid behandelten Pilzes Nigrospora oryzae synthetisiert wurden, an Wurmparasiten unter Verwendung eines Cestodenmodells (Bandwurm)27. Die Studie ergab Veränderungen in der Enzymaktivität und Auswirkungen auf die normale physiologische Funktion des Parasiten nach der Behandlung mit Goldnanopartikeln.

In dieser Forschungsarbeit konzentrieren wir uns auf die bio-augmentierte Synthese von AgNPs unter Verwendung eines wässrigen Extrakts von medizinisch wichtigem CLE. Clerodendrum ist eine Gattung blühender Pflanzen aus der Familie der Lamiaceae (Verbenaceae), die in den Ebenen Indiens sehr verbreitet ist und in Westbengalen weit verbreitet ist. Obwohl es weltweit über 400 Arten der Gattung Clerodendrum gibt, wurden bisher nur wenige untersucht und untersucht28. Pflanzen der Gattung Clerodendrum sind für ihre pestiziden Eigenschaften bekannt, und verschiedene Clerodendrum-Arten wie C. indicum, C. phlomidis, C. serratum var. amplexifolium, C. trichotomum, C. chinense, C. petasites wurden in der Vergangenheit als Volks- und traditionelle Medizin zur Behandlung von Krankheiten wie Erkältung, Hyperpyrexie, Asthma, Furunkulose, Bluthochdruck, Rheuma, Ruhr, Mammitis, Zahnschmerzen, Anorexie, Leucodermie, Lepra, Arthrophlogose und andere entzündliche Erkrankungen an zahlreichen Orten auf der ganzen Welt wie Indien, China, Korea, Japan, Thailand und Afrika29,30,31. Die Blüten von C. paniculatum zeigten eine hohe antioxidative und hepatoprotektive Kapazität, während die Blüten von C. volubile Auswirkungen auf den phagozytischen Atemstoß zeigten, was auf ein immunmodulatorisches Potenzial hinweist32,33. Der Stängel, die Blätter und die Blüten enthalten Triterpene, Steroide und Flavonoide, und Stämme verwenden verschiedene Teile der Pflanze bei Koliken, Skorpionstichen und Schlangenbissen, Pocken, Tumoren und bestimmten Hautkrankheiten34,35,36,37. Frühere Studien weisen auf das Vorhandensein der oben genannten Sekundärmetaboliten in Pflanzen hin, die als Schlüsselfaktoren für die Morphologie und Stabilisierung von Nanopartikeln fungieren. Es macht die Synthese von AgNPs ökologisch nachhaltig, kostengünstig und ungefährlich38. Die aktuelle Arbeit zielt darauf ab, die in vitro anthelmintische Aktivität von AgNPs zu untersuchen, die aus dem wässrigen Blütenextrakt von CLE auf der Cestode Raillietina spp. erzeugt werden. Die Studie wird die Wirksamkeit der AgNPs als potenzielle anthelmintische Behandlung bewerten und zum Verständnis der Mechanismen beitragen, die ihrer anthelmintischen Aktivität zugrunde liegen. Die Ergebnisse dieser Studie könnten neue Einblicke in die Entwicklung nachhaltiger und umweltfreundlicher Behandlungen für Helmintheninfektionen liefern und dazu beitragen, das Problem der Arzneimittelresistenz bei aktuellen Behandlungen anzugehen.

Die therapeutischen Eigenschaften der CLE-Blüte können mit dem Vorhandensein von Sekundärmetaboliten wie Alkaloiden, Flavonoiden, Saponinen, Phenolen und Tanninen in Verbindung gebracht werden. Tabelle 1 zeigt die phytochemische Analyse des wässrigen Extrakts aus den Blüten. Diese sekundären Pflanzenstoffe sind für die Reduktion, Verkappung und Stabilität der erzeugten AgNPs von entscheidender Bedeutung, da sie auch dazu beitragen, die Agglomeration von Nanopartikeln zu verhindern und ihre biologische Aktivität zu steigern.

AgNPs weisen eine starke Absorptionsbande auf und erzeugen aufgrund der Oberflächenplasmonresonanz (SPR)39 eine spezifische Farbe in Lösung. Die farblose AgNO3-Lösung wurde nach zwei Stunden blassgelb und nach 12 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur dunkelbraun (Abb. 1a). Die am Ende der Synthese beobachtete dunkelbraune Farbe könnte aufgrund der Stimulation der für AgNPs spezifischen Oberflächenplasmonvibrationen im Wellenlängenbereich von 400–500 nm auftreten40. Die Reduktion von Ag+-Ionen zu Ag° während der Reaktion mit den Inhaltsstoffen im CLE-Extrakt wurde durch UV-Vis-Spektroskopie für den Wellenlängenbereich 350–1100 nm beobachtet. Die Größe des Absorptionspeaks nahm aufgrund der erhöhten Anzahl an AgNPs mit der Reaktionszeit zu. Die maximale Absorption der CLE-AgNP-Probe wurde bei 405 nm gefunden (Abb. 1a), was die Bildung der gewünschten AgNPs bestätigte.

(a) UV-sichtbare Spektren von aus CLE-Blütenextrakt synthetisierten AgNPs als Funktion der Reaktionszeit. (b) FTIR-Spektrum des wässrigen CLE-Extrakts. (c) FTIR-Spektrum synthetisierter CLE-AgNPs.

FTIR-Spektren wurden aufgezeichnet, um wahrscheinliche funktionelle Gruppen der im wässrigen CLE-Blütenextrakt vorhandenen Biomoleküle zu identifizieren, die für die Bildung und Stabilisierung von CLE-AgNPs verantwortlich sind (Abb. 1b und c). Die starken Banden in Abb. 1b bei 3418, 2922, 2361, 1647, 1541, 1383, 1261, 1028, 808 und 669 cm−1 stimmen mit den für die AgNP-Bildung verantwortlichen Verkappungsmitteln überein. Die Schwingungsbande bei 3418 cm−1 in den Spektren wird der O-H-Streckschwingung in Alkoholen und Phenolen zugeordnet. Die Peaks bei 2912 und 2361 cm−1 entsprechen C–H- bzw. C–O- bzw. N–H-Streckschwingungen. Der starke Peak bei 1647 cm−1 weist auf eine C = O-Streckung hin, die durch das Vorhandensein der Carbonylgruppe entsteht, was auf das Vorhandensein von Flavonoiden und Terpenoiden hinweist. Der Peak bei 1383 cm−1 entspricht der C = O-Streckschwingung in Carbonsäuren. Der Peak bei 1261 cm−1 entspricht der CO-Streckung. Die Peaks bei 1028 und 808 cm−1 werden der Amin-C-N- bzw. C-H-Streckung zugeordnet. Die Spektren zeigten auch einen scharfen Peak bei 669 cm−1, der der N-H-Streckschwingung der primären und sekundären Amine und Amide entspricht. Die FTIR-Analyse des CLE-AgNPs-Extrakts ergab ähnliche Absorptionspeaks um 3420, 2931, 2359, 1645, 1383, 1264, 1036, 810 und \(617\) cm−1, was auf das Vorhandensein funktioneller Gruppen hinweist, die mit AgNPs identisch sind. Im CLE-AgNP-Spektrum wurde ein Verschwinden des mit Polyolen verbundenen Peaks bei 1541 cm-1 festgestellt. Die in den FTIR-Spektren beobachteten Veränderungen (Abb. 1b und c) schließen auf die Assoziation von Phenolen, Flavonoiden und Terpenoiden mit funktionellen Gruppen von Amiden, Aminen, Alkoholen, Carbonsäuren und Ketonen in der Bioreduktionsreaktion9,41.

Um die kristalline Phase zu identifizieren und die AgNP-Bildung weiter zu bestätigen, wurde das Röntgenbeugungsmuster von Silbernanopartikeln beim UGC-DAE-Konsortium für wissenschaftliche Forschung in Kalkutta aufgezeichnet (Bruker d8 Advance Röntgendiffraktometer, CuKα-Strahlung (λ = 1,5406 Å)). , 40 kV − 40 mA, 2θ/θ-Scanmodus). Die Daten wurden für den 2θ-Bereich von 20 bis 80 Grad mit einer Schrittweite von 0,0202 Grad erfasst. Die XRD-Muster zeigen vier charakteristische Peaks bei 38,188, 44,364, 64,53 und 77,485 Å (Abb. 2a). Diese Peaks entsprechen den Kristallebenen (111), (200), (220) bzw. (311) und stimmen mit den Pulverbeugungsstandardwerten der Miller-Indizes (hkl) von Silber überein40. Die Beugungswinkel entsprachen der kubisch-flächenzentrierten (FCC) Struktur von Silber in AgNPs und stimmten mit der Standard-Pulverbeugungskarte des Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) für Silber überein (Aktenzeichen: 04–0783)42 . Die durchschnittliche Kristallgröße \(D\) der AgNPs wurde aus dem Diffraktogramm unter Verwendung der Debye-Scherrer-Formel geschätzt, \(D=\) \(0,9\lambda /\beta \mathrm{Cos} \theta\), Dabei ist \(\lambda\) die Wellenlänge der zur Beugung verwendeten Röntgenstrahlen, θ der Bragg-Winkel und \(\beta\) die Halbwertsbreite (FWHM) einer Beugungsbande43. Basierend auf dem XRD-Spektrum des CLE-AgNP wurde die durchschnittliche Kristallgröße der Nanopartikel mit \(27,67\) nm berechnet.

(a) Röntgenbeugungsmuster synthetisierter CLE-AgNPs. (b) SEM-Aufnahme von CLE-AgNPs (15 kV, 30 kX). (c) Ein typisches TEM-Mikrobild von synthetisierten CLE-AgNPs. (d) CLE-AgNPs-Größenverteilung, extrahiert aus TEM-Bildern. Die durchgezogene schwarze Kurve ist eine Gaußsche Anpassung an die Daten.

Die mittels REM charakterisierte Morphologie von CLE-AgNPs ergab körnige und kugelförmige Partikel mit Durchmessern von weniger als 50 nm, wie in Abb. 2b dargestellt. Einige Partikel im REM-Bild erscheinen aufgrund der Aggregation von Nanopartikeln, die durch die Verdunstung des Lösungsmittels aufgrund der Trocknung am kritischen Punkt während der Probenvorbereitung verursacht wird, größer als die durchschnittliche Größe.

Die Dispersion, Aggregation, der kristalline Zustand und die Größe der CLE-AgNPs wurden mittels TEM untersucht, wie in Abb. 2c gezeigt. Die Größen der CLE-AgNP-Partikel wurden mit ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) gemessen und ein Größenhistogramm berechnet. Die Gaußsche Anpassung des Histogramms ergab, dass die mittlere Partikelgröße von CLE-AgNPs \(27,75 \pm 3,13\) nm (Mittelwert ± Standardabweichung, N = 90) betrug (Abb. 2d). Die mittels TEM untersuchte Oberflächenmorphologie zeigte klare Hinweise auf die Bildung metallischer Kristalle von CLE-AgNPs, die gleichmäßig verteilt waren und weniger Partikelaggregation aufwiesen, und die Partikel bildeten eine Kugelform. Das Vorhandensein einiger größerer Nanopartikel kann auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass CLE-AgNPs aufgrund ihrer hohen Oberflächenenergie und hohen Oberflächenspannung der ultrafeinen Nanopartikel zur Aggregation neigen.

Raillietina spp., inkubiert im Kontrollmedium (nur PBS), zeigte über einen längeren Zeitraum körperliche Aktivität; Die Kontrollen überlebten etwa 72,00 ± 0,04 Stunden, danach wurden sie immobilisiert und starben (Abb. 3). Bei der Exposition gegenüber dem Testmedium CLE-AgNP und Genistein (Referenzarzneimittel) gingen die Parasiten vom kräftigen Bewegungszustand in den entspannten Zustand über, woraufhin sie eine Lähmung erreichten, die zum Tod führte. Die In-vitro-Bewertung der Wirksamkeit von CLE-AgNPs gegen den Cestodenparasiten ergab eine Lähmungszeit von 1,51 h, 1,17 h, 0,59 h, 0,48 h, 0,43 h und eine Todeszeit von 2,48 h, 2,11 h, 1,41 h, 1,27 h. 1,07 h für Dosierungen von 25, 50, 75, 100 bzw. 125 µg/ml. Wir beobachteten eine verringerte anthelmintische Wirkung auf den Cestodenparasiten, wenn er nur wässrigem CLE-Extrakt ausgesetzt wurde (Ergänzungstabelle S1).

Ergebnisse der Wirksamkeit von CLE-AgNP auf Raillietina spp. nach Exposition gegenüber fünf verschiedenen Konzentrationen (25, 50, 75, 100 und 125 µg/ml in PBS).

REM-Bilder der Kontrollparasiten zeigen ein Rostellum und vier seitlich um den Skolex angeordnete Saugnäpfe, jeweils mit Kreisen aus breiten Haken an der Unterseite, die sich verjüngen und zu den Enden hin gebogen sind (Abb. 4a). Bei höherer Vergrößerung zeigt sich, dass die Oberflächenhaut des Proglottids mit glatten, homogenen Mikrotrichen bedeckt ist, die die absorbierenden Strukturen für die Nahrungsaufnahme darstellen (Abb. 4d). Bei Einwirkung des Testmediums degenerierte jedoch die allgemeine Oberflächentopographie der Proglottiden unter Bildung von Falten (Abb. 4f). Die mit CLE-AgNP behandelte Zestode zeigte eine unwiderrufliche Zerstörung des Skolex, der stark verzerrt erschien, mit stark geschrumpften Saugnäpfen und stark krummen Stacheln um die Saugnäpfe herum. Die filamentöse Natur der Mikrotrichen ging verloren und die Stacheln um die Saugnäpfe herum waren gebrochen und erodiert (Abb. 4c), was die Beibehaltung der Parasitenposition auf der Wirtszelle veränderte und sich auf deren Ernährung auswirkte. Die mit Genistein behandelten Parasiten zeigten eine enorme Entstellung des Skolex, einen Bruch und eine Ablösung der tegumentalen Oberflächenstrukturen (Abb. 4b, e).

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Kontrollwürmern ((a) Skolex, (d) gravider Proglottid), Genistein ((b) Skolex, (e) gravider Proglottid) und Silbernanopartikeln ausgesetzten Raillietina spp. ((c) Skolex, (f) gravider Proglottid).

Das Tegument (T) der Kontrollart Raillietina spp. zeigten eine intensive Aktivität von saurer Phosphatase (AcPase), saurer Phosphatase (AlkPase), Adenosintriphosphatase (ATPase) und 5'-Nukleotidase (5'-Nu) im Vergleich zu Subtegument (ST) und somatischer Muskulatur (SM) (Abb. 5a). -D). Abbildung 5e – h zeigt die histologischen Schnitte von CLE-AgNP-exponierten Parasiten, die eine allgemeine Verringerung der Färbungsintensität in T, ST und SM zeigen, während die Parenchymzellen (P) unbeeinträchtigt blieben. AcPase zeigte eine deutliche Verringerung der Färbungsintensität in der T- und ST-Region für den mit AgNP inkubierten Abschnitt (Abb. 5a, e), was auf eine Störung des parasitären Membrantransportstoffwechsels hinweist. Allerdings war im gesamten Bereich der Parasiten, die Genistein ausgesetzt waren, nur eine minimale Aktivität zu verzeichnen (Abb. 5i – l). In den behandelten Abschnitten des Parasiten wurde eine stark verminderte Aktivität von AlkPase beobachtet (Abb. 5b, f). Die ATPase-Aktivität war im T und ST des mit CLE-AgNP behandelten Parasiten im Vergleich zu den Kontrollparasiten kaum wahrnehmbar (Abb. 5c, g). Es wurde auch festgestellt, dass die 5'-Nu-Aktivität in der gesamten T- und ST-Region in den AgNP-exponierten Cestoden im Vergleich zur Kontrolle verringert war (Abb. 5d, h). Der Rückgang der enzymatischen Aktivitäten resultierte aus den durch die CLE-AgNPs verursachten Hautschäden.

Histochemischer Nachweis der Aktivitäten von AcPase (a,e,i), AlkPase (b,f,j), ATPase (c,g,k) und 5'-Nu (d,h,l) in Raillietina spp. behandelt mit (125 μg/ml) und Genistein (125 μg/ml); (a–d) Querschnitt des Kontrollparasiten; (e–h) AgNPs-exponierter Parasit; (i–l): Genistein-exponierter Parasit. Alle Maßstabsbalken entsprechen 50 μm.

Wir nutzten Clerodendrum-Blüten für die extrazelluläre Produktion von Silbernanopartikeln und demonstrierten ihre Fähigkeiten als Alternative zu synthetischen chemischen Techniken. In jüngster Zeit hat die Synthese von Nanopartikeln aus natürlichen Quellen große Beachtung gefunden. Organische Nanopartikel wie Chitosan und Lipid-Nanopartikel sowie anorganische Nanopartikel wie Gold wurden als Nano-Arzneimittelabgabesysteme verwendet45,46,47,48,49. Die Art der bakteriziden Wirkung von Nanopartikeln ist noch nicht vollständig geklärt. Es zerstört jedoch irreversibel die bakterielle Zellwand, inaktiviert lebenswichtige Proteine, chelatisiert DNA und bildet reaktive Sauerstoffspezies, von denen bekannt ist, dass sie eine hohe mikrobizide Aktivität aufweisen41,49,50,51,52. Während Mikroorganismen weiterhin für die Synthese von Metall-Nanopartikeln untersucht werden, ist die Verwendung von Pflanzenextrakten in der Biosynthese von Nanopartikel-Herstellungsprozessen eine attraktive Perspektive, die noch weitgehend unbekannt und zu wenig genutzt wird. In der aktuellen Untersuchung konzentrierten wir uns auf die grüne Synthese von CLE-AgNP durch Zugabe von Pflanzenextrakt zur AgNO3-Lösung (Abb. 6a), was zunächst durch die Farbveränderungen der Lösung von farblos nach blassgelb bestätigt und später spektrophotometrisch gemessen wurde ( Abb. 1a). Die Intensität der Farbe nahm direkt proportional zur Inkubationszeit zu und der höchste Absorptionspeak zeigte den maximalen Ertrag an. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Pflanzen Phenole und Flavonoide mit großer antioxidativer Wirkung enthalten, die die Synthese von Nanopartikeln ermöglichen53,54. Der Nachweis verschiedener Phytobestandteile in C. infortunatum-Blüten, die auf Flavonoide, Saponine, Phenol und Tannine mit potenziellen therapeutischen Zielen untersucht wurden, begründete unser Ziel bei der Herstellung von CLE-AgNPs. Obwohl der genaue zugrunde liegende Mechanismus zur Bildung von AgNPs unklar ist, wurde vorgeschlagen, dass die verschiedenen aktiven funktionellen Gruppen von sekundären Pflanzenstoffen in CLE-Blüten für die Biosynthese von AgNPs verantwortlich sind, indem sie Ag-Ionen in ihre elementare Form reduzieren (Abb. 6b). Auf die Bioreduktion von Silberionen folgt die Keimbildung und das Wachstum der benachbarten reduzierten Silberatome zu Silbernanopartikeln charakteristischer Form und Größe. Abschließend werden die neu synthetisierten Nanopartikel durch die Verkappung mit den sekundären Pflanzenstoffen stabilisiert. Die Verkappungsmittel wurden durch die FTIR-Analysen der Nanopartikel bestätigt. Bei CLE-AgNPs beobachteten wir, dass die meisten der im wässrigen Blütenextrakt vorhandenen funktionellen Gruppen im synthetisierten Nanopartikel intakt waren. Die Absorptionsbanden repräsentierten hauptsächlich das Vorhandensein funktioneller Gruppen wie Phenol, Ketone, Carbonsäuren, Amine und Amide. Im Vergleich zum CLE-Blütenextrakt zeigten die FTIR-Messungen von CLE-AgNP das Verschwinden des Peaks bei 1541 cm−1, was darauf hinweist, dass die Polyole wie Flavonoide und Terpenoide im CLE-Extrakt hauptsächlich für die Reduzierung von Silberionen verantwortlich sind. Die Peakverschiebung von 669 cm−1 auf 617 cm−1 in den Absorptionspeaks legt nahe, dass die Aminkomponenten an der Reduktion und Stabilisierung der Nanopartikel beteiligt sind. (Abb. 1b,c). Darüber hinaus deutete der scharfe Peak bei 1645 cm-1 auf das Vorhandensein von Flavonoiden und Terpenoiden hin, was mit den Berichten der qualitativen Untersuchung von Phytochemikalien übereinstimmte (Tabelle 1). In einer ähnlichen Studie haben Jayakumar et al. demonstrierten die Verwendung von FTIR zum Nachweis von Biomolekülen zur Reduzierung von Ag+-Ionen und zur Verkappung von durch Clerodendrum splendens-Extrakt produzierten AgNPs57. CLE-AgNP war kristallin, größtenteils kugelförmig, mit variabler Partikelgröße und elementarer Natur (Abb. 2a). Die Kristallitgröße des Materials wurde anhand von XRD-Messungen auf etwa \(27,67\) nm ermittelt. Zusätzlich zu den vier Haupt-XRD-Peaks im Diffraktogramm könnten weitere nicht identifizierte Peaks auf die Bildung der kristallinen Biomoleküle zurückzuführen sein, die an die Oberfläche der AgNPs gebunden sind. Die SEM- und TEM-Analyse bestätigte auch die Synthese von AgNPs variabler Größe (12–44 nm, Mittelwert ≈ 27) und Kugelform (Abb. 2b – d).

Eine schematische Abbildung, die (a) die pflanzenvermittelte Synthese von Silbernanopartikeln (b) den möglichen zugrunde liegenden Mechanismus der CLE-AgNP-Synthese aus den pflanzlichen Metaboliten zeigt.

Jüngste Studien weisen darauf hin, dass kleinere Nanopartikel für die Bereitstellung vieler Ziele nützlich sind, insbesondere für die antimikrobielle Aktivität, da sie der Bakterienmembran stärker an der Oberfläche ausgesetzt sind, was die Zellpermeabilität erhöht und zum Zelltod führt58. Ihre geringe Größe ermöglicht außerdem eine effiziente Medikamentenakkumulation an den Zielorten und sorgt für eine anhaltende Medikamentenfreisetzung59. Die in Abb. 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass CLE-AgNP tatsächlich eine anthelmintische Wirksamkeit gegen Geflügel-Cestode Raillietina spp. hat. und wirkt dosis- und zeitabhängig. Die individuelle Wirkung von CLE-Blütenextrakt bei der höchsten Dosis (125 µg/ml) betrug 2,75 ± 0,1 Stunden und 3,21 ± 0,14 Stunden für Lähmungen bzw. Tod, während seine anthelmintische Aktivität in Kombination mit Silberpartikeln verstärkt wurde (Ergänzungstabelle S1). . Frühere Studien deuten darauf hin, dass sekundäre Pflanzenstoffe und ihre stabilisierenden Eigenschaften eine tiefgreifende kolloidale Aktivität haben könnten, die sich gegenseitig synergistisch beeinflusst, wenn der Extrakt auf AgNPs60 aufgetragen wird. Die wirksamste Dosis von CLE-AgNP betrug 125 µg/ml, wobei der Beginn der Lähmung der Parasiten nach 0,43 Stunden und der Tod nach 1,07 Stunden der Behandlung auftrat (Abb. 4). Die Ergebnisse der Rasterelektronenmikroskopie haben eine erkennbare topografische Verstümmelung bei den Testwürmern gezeigt, während der Kontrollbandwurm ein glattes und organisiertes Rostellum, einen Saugnapf und Mikrotrichen am Kopf und am Strobila-Teil aufweist. Wie in der vorliegenden Untersuchung beobachtet, hat die Tegumenterosion die Schnittstelle zwischen Wirt und Parasit verändert und zu einem schweren Nährstoffmangel innerhalb des Parasiten geführt. Neben der Aufnahme von Nährstoffen besteht die mögliche Rolle der wirbelsäulenähnlichen Merkmale der Mikrotriches darin, ihren Wirt beizubehalten und seine Position im Darm aufrechtzuerhalten. Daher führt eine Störung der Mikrotriche zu einer verringerten Bindungsfähigkeit der Parasiten an den Wirt. Ähnliche Beobachtungen wurden bei der Inkubation des Parasiten in Resveratrol gemacht, was bei Raillietina spp. zu Blasenbildung, Anschwellen der Haut, Verlust der Stacheln und Verformung der Saugnäpfe führt. in vitro exponiert61. Bei der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen rohen ethanolischen Sprossextrakts traditionell verwendeter Heilpflanzen wie Alpinia nigra62 wurde eine ausgedehnte Blasenbildung auf der Oberfläche von Fasciola hepatica beobachtet. Andere Phytoverbindungen wie α-Viniferin sind eindeutig für Schäden in unterschiedlichem Ausmaß an der Haut von Cestoden verantwortlich63. In einer kürzlich durchgeführten Studie zeigten die Haut und die Saugnäpfe des Bandwurms Raillietina tetragona sowie die Kutikula und Lippen des Fadenwurms Ascardia galli schwere Schäden bei der Behandlung mit dem Wurzel- und Rhizomextrakt der ethnomedizinischen Pflanze Imperata cylindrica64. Es wurde festgestellt, dass die tegumentalen Enzyme AcPase und AlkPase an der Aufnahme bestimmter Nährstoffe, Glykogen und Lipoprotein in verschiedenen Helminthenparasiten beteiligt sind65. Enzymatische Veränderungen in histochemischen Lokalisierungsstudien zeigten ebenfalls deutliche Auswirkungen (Tabelle 2). ATPase ist mit einem aktiven Transport verbunden, und eine signifikante Verringerung seiner Aktivität in der somatischen Muskulatur sowie das völlige Fehlen in den Tegument- und Subtegumentalschichten bei 125 µg/ml CLE-AgNP-exponierten Parasiten weisen weiter auf eine Störung des Energiestoffwechselwegs hin im Parasiten. In einer früheren Studie wurden nach der Behandlung mit Genistein, dem aktiven Bestandteil von Flemingia vestita, die tegumentalen Enzyme wie AcPase, AlkPase, ATPase und 5'-Nu von Raillietina spp. Es wurde festgestellt, dass sie um ein Vielfaches verringert waren66. Somit könnte die beobachtete Abnahme der beiden tegumentalen Phosphataseaktivitäten mit der Hemmung oder verminderten Glukoseabsorption durch Raillietina spp. zusammenhängen, was zu einem fortschreitenden Verlust der motorischen Funktion aufgrund eines Mangels an Energiequellen und schließlich zu Lähmungen und Tod führen würde.

Zusammenfassend zeigt unsere Untersuchung einen prägnanten, kostengünstigen und produktiven Weg zur Phytosynthese von AgNPs unter Verwendung des wässrigen Blütenextrakts von CLE auf. Darüber hinaus sind In-vivo-Studien erforderlich, um die Wirkungsweise des Arzneimittels und seine Pharmakokinetik zu verstehen. Zukünftig kann die Optimierung des Testtherapeutikums (CLE-AgNP) durch pharmazeutische Bewertung und Anwendung einer geeigneten Fütterungsstrategie durch Ermittlung der Auswirkungen auf Stoffwechselvorläufer und intrazelluläre Metaboliten zu einem nahtlosen Übergang zu einem finanziell machbaren ethnomedizinischen Anthelminthikum beitragen. Wir glauben, dass die Verwendung grüner Synthesemethoden zur Herstellung von Silbernanopartikeln aus Clerodendrum infortunatum-Blüten eine vielversprechende Alternative zu synthetischen Anthelminthika zur Behandlung von Helmintheninfektionen bei Hausgeflügel darstellen könnte.

Die frischen und gesunden Blüten von Clerodendrum infortunatum wurden über einen Zeitraum von zwei Monaten zwischen Mai und Juni 2021 im Campusgarten der Cooch Behar Panchanan Barma University (CBPBU) (Breitengrad 26,321796 °N, Längengrad 89,469329 °E) gesammelt. Dr. Chaya Deori tat dies Die taxonomische Bewertung und das Belegexemplar (AC-97296) wurden im Herbarium des Botanical Survey of India, Eastern Regional Centre, Shillong, aufbewahrt. Wir bestätigen, dass die Sammlung des Pflanzenmaterials den relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen entspricht. Die entsprechenden Genehmigungen zum Sammeln von Pflanzenproben wurden von der CBPBU-Verwaltung eingeholt, die der Regierung von Westbengalen, Indien, angeschlossen ist.

Die Blüten wurden nacheinander gründlich mit Leitungswasser und entionisiertem Wasser gewaschen, an der Luft getrocknet und in kleine Stücke geschnitten. Gehackte Blüten (20 g) wurden zu 100 ml entionisiertem autoklaviertem Wasser in einem Becherglas gegeben und in einem temperaturkontrollierten Wasserbad 10 Minuten lang auf 90 °C erhitzt. Der Extrakt wurde abgekühlt, durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert und bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.

Die phytochemische Analyse des Clerodendrum infortunatum-Blütenextrakts wurde unter Verwendung wässriger Extrakte unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Standardverfahren durchgeführt, mit geringfügigen Modifikationen zur Identifizierung der verschiedenen Bestandteile.

Für die Silbernanopartikelsynthese wurden etwa 10 ml CLE-Blütenextrakt zu einer 90 ml wässrigen Lösung von 1 mM AgNO3 (Merck Laboratories, Indien) gegeben und bei Raumtemperatur gehalten. Die Farbe änderte sich von blassgelb nach braun, was auf die Bildung der AgNPs aufgrund der Reaktion von CLE-Blütenextrakten mit Silbermetallionen hinweist. Die Kontrolle wurde ohne Zugabe von Blütenextrakt zur Silbernitratlösung aufrechterhalten, die keine Farbveränderungen zeigte. Die gereinigten AgNPs wurden durch Entfernen des Extrakts durch dreimaliges Zentrifugieren der Suspension bei 15.000 U/min für 20 Minuten und anschließendes zweimaliges Waschen mit doppelt sterilisiertem Wasser erhalten.

Sichtbare Farbveränderungen bestimmten vorläufig den Bioreduktionsprozess von Silberionen in Lösung und wurden später mithilfe der UV-sichtbaren Absorptionsspektroskopie (Hitachi U-2900) überwacht. Die synthetisierten AgNPs wurden gefriergetrocknet, pulverisiert und für die XRD-Analyse verwendet. Das getrocknete Pulver wurde mit Kaliumbromid im Verhältnis 1:100 gemischt und die Ergebnisse wurden mittels FTIR (Jasco FR/IR-6300) aufgezeichnet. Die CLE-AgNPs wurden am kritischen Punkt getrocknet, über einem Kohlenstoffband auf einen REM-Stummel gelegt, mit Platin beschichtet und unter einem Rasterelektronenmikroskop (Zeiss EVO-18) bei einer Spannung von 15 kV betrachtet, um die Oberflächenmorphologie der biogenen AgNPs zu beurteilen . Transmissionselektronenmikroskopie (JEOL JEM-2100 HR) wurde verwendet, um die Größe und Morphologie von AgNPs zu verstehen.

Lebende ausgewachsene Raillietina spp. (Megnin, 1880) (Klasse: Cestoda; Ordnung: Cyclophyllidea; Familie: Davaineidae) wurden aus dem Darm von frisch geschlachtetem Hausgeflügel (Gallus gallus Domesticus L.) aus örtlichen Schlachthöfen in Cooch Behar gesammelt und in \(0,9\%\) gehalten. ) PBS bei \(37\pm 1^\circ \mathrm{C}\) in einem Inkubator. Kontrollparasiten wurden in \(0,9\%\) PBS (pH \(7,2\)) bei \(37\pm 1^\circ \mathrm{C}\) gehalten, wohingegen zur Behandlung lebende Würmer direkt in anderen inkubiert wurden Konzentrationen der Testbehandlung (\(25, 50, 75, 100, 125\) µg/ml) in separaten Petrischalen, sowohl für den wässrigen CLE-Blütenextrakt als auch für CLE-AgNPs. In ähnlicher Weise wurde auch die Behandlung mit Genistein in einer Dosis von \(125\) µg/ml PBS als Breitband-Referenzarzneimittel durchgeführt. Für jeden Satz Inkubationsmedien wurden sechs Replikate hergestellt und die Zeit bis zum Erreichen des paralytischen Zustands und des Todes aufgezeichnet. Die Sterblichkeit der Parasiten wurde bestätigt, indem die behandelten Parasiten aus dem Testmedium entfernt und in leicht lauwarmes Wasser getaucht wurden, was durch das Aufhören aller Anzeichen von Bewegung angezeigt wurde. Die Kontrollparasiten und die mit CLE-AgNP behandelten Parasiten wurden aus den jeweiligen Inkubationsmedien entnommen und für histochemische und elektronenmikroskopische Untersuchungen verarbeitet.

Die Parasiten wurden unmittelbar nach der Lähmung 24 Stunden lang in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Nach der Fixierung wurde die Probe in PBS gespült und mit Acetonqualitäten von reinem trockenem Aceton bis hin zu Aceton in steigenden Konzentrationen dehydriert. Anschließend wurden die Proben unter Verwendung von flüssigem Kohlendioxid als Übergangsflüssigkeit am kritischen Punkt getrocknet, das auf einen Metallstummel gegeben und in einem Feinschicht-Ionensputter JFC-1100 (JEOL) mit Platin beschichtet wurde. Anschließend wurden die Proben mit einem Rasterelektronenmikroskop Zeiss EVO-18 (Special Edition) bei einer Beschleunigungsspannung von 10–15 kV betrachtet.

Die tegumentalen Enzyme wurden histochemisch anhand ordnungsgemäß verarbeiteter Gefrierschnitte untersucht, die in einem Leica CM 3050S-Kryostat mit einer Dicke von 10–12 µm geschnitten wurden. Die AcPase-Aktivität wurde in mit kaltem Formol-Calcium fixierten Proben nach der modifizierten Bleinitrat-Methode67 unter Verwendung von Natrium-β-Phosphoglycerat als Substrat nachgewiesen, wobei ein bräunlicher Niederschlag auf Tegumentalschnitten die Stellen der AcPase-Aktivität anzeigt. Die modifizierte Azo-Farbstoff-Kopplungsmethode bewertete die AlkPase-Aktivität bei Raumtemperatur (17–20 °C). Zum Nachweis der Lokalisierung der ATPase-Aktivität wurde die Calcium-Methode von Pearse eingesetzt, wobei Adenosintriphosphat als Substrat verwendet wurde und die Enzymaktivität durch Beobachtung schwarzbrauner Ablagerungen bestimmt wurde67. Zur Beobachtung von 5'-Nu wurde die Leitmethode von Wachstein und Meisel unter Verwendung von Adenosinmonophosphat als Substrat68 eingesetzt. Die histologischen Schnitte wurden mit dem 5-Phasen-Kontrastmikroskop Axiolab von Carl Zeiss betrachtet.

Wir bestätigen, dass für jeden Aspekt der in diesem Manuskript behandelten Arbeit keine ethische Genehmigung erforderlich ist.

Die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendeten Daten sind im Artikel enthalten; Die Rohdaten sind jedoch auf Anfrage auch beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Dr. Debkumar Mukhopadhyay, Vizekanzler der CBPBU, von ganzem Herzen für seine Unterstützung und Ermutigung sowie für die Bereitstellung der notwendigen Laboreinrichtungen. Die Autoren danken auch dem UGC-DAE-Konsortium, Kalkutta, für die XRD-Einrichtung und dem Center for Research in Nanoscience and Nanotechnology, University of Calcutta (CRNN, CU), für die Erlaubnis, ihre SEM-, TEM- und FTIR-Einrichtung zu nutzen.

Labor für Parasitologie, Abteilung für Zoologie, Cooch Behar Panchanan Barma University, Vivekananda Street, Cooch Behar, 736101, Westbengalen, Indien

Rima Majumdar & Pradip Kumar Kar

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RM und PKK konzipierten die Idee und gestalteten die Forschung. RM führte die Experimente durch, analysierte und interpretierte die Daten. RM und PKK haben das Manuskript geschrieben. Wir bestätigen, dass alle Autoren das Manuskript gelesen und genehmigt haben und dass keine anderen Personen die Autorenschaftsanforderungen erfüllt haben, jedoch nicht einbezogen sind. Wir bestätigen weiterhin, dass alle der Reihenfolge der im Manuskript aufgeführten Autoren zugestimmt haben.

Korrespondenz mit Pradip Kumar Kar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Majumdar, R., Kar, PK Biosynthese, Charakterisierung und anthelmintische Aktivität von Silbernanopartikeln aus Clerodendrum infortunatum-Isolat. Sci Rep 13, 7415 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34221-9

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Eingegangen: 14. März 2023

Angenommen: 26. April 2023

Veröffentlicht: 07. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34221-9

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Parasitologische Forschung (2023)

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