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Sep 13, 2023

Ein RNA-Modifikationsenzym erkennt direkt reaktive Sauerstoffspezies für die Translationsregulation in Enterococcus faecalis

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4093 (2023) Diesen Artikel zitieren 4212 Zugriffe auf 106 Details zu altmetrischen Metriken Bakterien verfügen über ausgeklügelte Systeme zur Verwaltung von reaktivem Sauerstoff und Stickstoff

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4093 (2023) Diesen Artikel zitieren

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106 Altmetrisch

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Bakterien verfügen über ausgefeilte Systeme zur Verwaltung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS), die durch die Einwirkung des Immunsystems von Säugetieren und Umweltstress entstehen. Hier berichten wir über die Entdeckung eines ROS-empfindlichen RNA-modifizierenden Enzyms, das die Translation von Stressreaktionsproteinen im Darmkommensal und opportunistischen Pathogen Enterococcus faecalis reguliert. Wir analysieren das tRNA-Epitranskriptom von E. faecalis als Reaktion auf reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oder subletale Dosen von ROS-induzierenden Antibiotika und identifizieren starke Abnahmen von N2-Methyladenosin (m2A) sowohl in 23 S-ribosomaler RNA als auch in Transfer-RNA. Wir gehen davon aus, dass dies auf die ROS-vermittelte Inaktivierung der Fe-S-clusterhaltigen Methyltransferase RlmN zurückzuführen ist. Durch den genetischen Knockout von RlmN entsteht ein Proteom, das die Reaktion auf oxidativen Stress nachahmt, mit einem Anstieg der Superoxiddismutase-Spiegel und einer Abnahme der Virulenzproteine. Während sich herausstellte, dass tRNA-Modifikationen für die Feinabstimmung der Translation dynamisch sind, berichten wir hier über die Entdeckung einer dynamisch regulierten, auf die Umwelt reagierenden rRNA-Modifikation. Diese Studien führten zu einem Modell, in dem RlmN als redoxempfindlicher molekularer Schalter fungiert, der oxidativen Stress direkt an die Modulation der Translation durch das rRNA- und tRNA-Epitranskriptom weiterleitet und so ein anderes Paradigma hinzufügt, bei dem RNA-Modifikationen das Proteom direkt regulieren können.

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wie Superoxid (O2−) und Wasserstoffperoxid (H2O2) spielen eine grundlegende Rolle bei der Gestaltung der bakteriellen Evolution1. Bakterien sind ROS aus einer Vielzahl von Quellen ausgesetzt, endogen als Nebenprodukte der aeroben Atmung und exogen aus redoxaktiven Naturprodukten und den respiratorischen/oxidativen Ausbrüchen aktivierter Immunzellen von Säugetieren2. Wenn ROS nicht neutralisiert werden, schädigen sie wesentliche Zellbestandteile, einschließlich DNA, Lipide, Kohlenhydrate und Proteine1. Bakterien haben daher ROS-Abwehrsysteme wie Superoxiddismutasen (SOD), Katalasen, Glutathion, Thioredoxinsysteme, Peroxidasen und Nitrat-/Nitritreduktasen entwickelt3. Diese Abwehrkräfte werden häufig transkriptionell durch ROS-empfindliche Transkriptionsfaktoren wie OxyR, PerR, OhrR und SoxR4,5,6 reguliert.

Aktuelle Erkenntnisse deuten auf Mechanismen der translatorischen Regulation bakterieller Stressreaktionssysteme hin. Beispielsweise beinhaltet die Reaktion auf hypoxischen Stress in Mykobakterien die Neuprogrammierung von Dutzenden modifizierter Ribonukleoside auf tRNAs – dem tRNA-Epitranskriptom –, um eine selektive Translation von Codon-abhängigen mRNAs aus Hypoxie-Reaktionsgenen zu bewirken, einschließlich des Transkriptionsfaktors DosR und seines Regulons7. Modifikationen an anderen RNA-Formen sind ebenfalls an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, indem sie die Stabilität, Struktur, Lokalisierung und Protein-RNA-Wechselwirkungen der RNA verändern8.

Hier berichten wir über die Entdeckung eines ROS-empfindlichen RNA-modifizierenden Enzyms, das die Translation von Stressreaktionsproteinen im Darmkommensal und opportunistischen Pathogen Enterococcus faecalis reguliert. Nach der Exposition gegenüber dem Superoxidgenerator Menadion oder subletalen Dosen von ROS-induzierendem Erythromycin und Chloramphenicol ergab die Analyse von 24 modifizierten Ribonukleosiden des Epitranskriptoms einen starken Rückgang des N2-Methyladenosins (m2A) sowohl in der ribosomalen 23 S-RNA als auch in der Transfer-RNA, die möglicherweise dadurch verursacht wurde ROS-vermittelte Inaktivierung der Fe-S-clusterhaltigen Methyltransferase RlmN. Der Verlust von RlmN veränderte die Proteinexpression in einer Weise, die eine Menadion-Exposition nachahmte, wie z. B. erhöhte Superoxiddismutase und verringerte Virulenzproteine. Diese Studien legen nahe, dass RlmN als redoxempfindlicher molekularer Schalter fungiert, der die umwelt- und antibiotikainduzierte ROS-Exposition mit der Epitranskriptomdynamik in ribosomaler und Transfer-RNA verknüpft, um die Translation von Stressreaktionsproteinen zu bewirken.

Während die Transkriptionsregulation als Reaktion auf Stress bei Bakterien gut etabliert ist, ist die Translationsregulation weniger gut verstanden. Unser Nachweis einer Hypoxie-induzierten Neuprogrammierung des Epitranskriptoms und einer Codon-abhängigen Translation in Mykobakterien7 führte uns zu der Hypothese, dass ein ähnlicher Mechanismus für die Reaktion von Enterococcus faecalis auf den Stress einer Antibiotika-Exposition gelten könnte. Hier haben wir 24 Modifikationen in der rRNA und tRNA in zwei E. faecalis-Stämmen quantifiziert: OG1RF, ein Stamm, der vom humanen kommensalen oralen Isolat OG19 abgeleitet ist, und V58310, ein multiresistentes klinisches Isolat. V583 besitzt eine Erythromycin-Resistenz-Methyltransferase (ErmB), die die N6-Position von Adenosin (m6A, m6,6A) in 23 S rRNA an Position 2058 (Escherichia coli-Nummerierung)11 methyliert und die Bindung von Makroliden (z. B. Erythromycin), Lincosamiden, und Streptogramin B (MLS)11, verleiht jedoch nur eine teilweise Resistenz gegen Erythromycin12. OG1RF fehlt ErmB und ist daher etwa 100-fach empfindlicher gegenüber Erythromycin als V583.

Wir untersuchten zunächst die antibiotische Wirkung auf das Epitranskriptom von V583, indem wir Zellen in Gegenwart subinhibitorischer Konzentrationen von Erythromycin (10–200 μg/ml; Abb. 1a) züchteten. Nach der Reinigung von 23 S- und 16 S-rRNAs und tRNA und der Hydrolyse zu Ribonukleosiden wurden 24 modifizierte Ribonukleoside durch chromatographisch gekoppelte Massenspektrometrie (LC-MS) in jedem RNA-Typ quantifiziert (Abb. 1b – d, Ergänzungstabelle 1)7. Weder m6A noch m6,6A stiegen in der 23 S-rRNA unter Erythromycin-Behandlung an, was bestätigt, dass die Erm-Expression in V583 konstitutiv ist12. Während die meisten der überwachten Veränderungen während der Behandlung relativ unverändert blieben, wurde bei Erythromycin-Exposition eine auffällige Verringerung von 2-Methyladenosin (m2A) sowohl in der 23 S-rRNA als auch in der tRNA beobachtet (Abb. 1b–d) mit Dosisabhängigkeit (Abb. 1e). , F).

ein Epitranskriptom-Profiling-Workflow. Log-Phase-Kulturen von V583 wurden mit Wachstumsmedium verdünnt, das Erythromycin unterhalb seiner MHK (10–200 µg/ml) enthielt, und 5–6 Verdoppelungen lang bis zur mittleren Log-Phase wachsen gelassen. Anschließend wurde die RNA isoliert und die RNA-Modifikationen durch LC quantifiziert -MS/MS. b–d Veränderungen im Ausmaß der RNA-Modifikationen in V583 bei unterschiedlichen Erythromycin-Dosen (Schlüssel unten in d) im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die Modifikationsniveaus werden als fache Änderung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle für 23 S-rRNA (b), 16 S-rRNA (c) und tRNA (d) angezeigt. Änderungen werden von links nach rechts in aufsteigender Retentionszeit angeordnet. In der Ergänzungstabelle 1 finden Sie Namen, Retentionszeiten sowie Vorläufer- und Produktion-Ionenmassen für die RNA-Modifikationen. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD für Fold-Change-Werte dar, die aus drei unabhängigen Messungen der RNA-Modifikations-normalisierten Signalintensität im Mutantenstamm dividiert durch die durchschnittliche Signalintensität für drei Wildtyp-Proben berechnet wurden. e, f Wirkung der Erythromycin-Dosis auf das Verhältnis von m2A zu Adenosin. Ribonukleoside wurden mithilfe von LC-MS-Kalibrierungskurven quantifiziert, wie im Einschub für tRNA dargestellt. Alle Daten stammen aus 3 Experimenten (Mittelwert ± SD, n = 3). Statistische Analyse mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett-Test im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen; *P < 0,05; **P < 0,005. e Genaue p-Werte: 30 μg/ml, 0,0291; 100 μg/ml, 0,0220; 200 μg/ml 0,0235. f Genaue p-Werte: 10 μg/ml, 0,0146; 30 μg/ml, 0,0062; 100 μg/ml, 0,0047; 200 μg/ml, 0,0055.

Um zu beurteilen, ob die m2A-Reduktion nur für V583 gilt, wiederholten wir die Studie mit E. faecalis OG1RF bei wachstumspermissiven Erythromycin-Konzentrationen (0,1–0,3 μg/ml; Ergänzungstabelle 2). Wir beobachteten erneut eine signifikante konzentrationsabhängige Abnahme von m2A sowohl in der 23 S-rRNA als auch in der tRNA (Abb. 2a, b), mit unbedeutenden Änderungen in den anderen 23 Modifikationen (ergänzende Abb. 3). Als nächstes fragten wir, ob die m2A-Reduktion nur auf Erythromycin zurückzuführen sei oder eine allgemeine Reaktion auf alle Antibiotika sei. Bei 10–25 % der MHK der verschiedenen Antibiotika (Ergänzungstabelle 2) wurde m2A durch die Makrolide Erythromycin und Spiramycin sowie das Phenicol-Antibiotikum Chloramphenicol reduziert, die alle bakteriostatisch sind, nicht jedoch durch die bakteriziden Wirkstoffe Ciprofloxacin, Ampicillin oder Aminoglykoside Kanamycin und Gentamicin (Abb. 2a – c). Makrolide und Chloramphenicol binden an die große (50 S) ribosomale Untereinheit am Peptidaustrittstunnel bzw. am Peptidyltransferasezentrum, während Aminoglykoside die kleine (30 S) ribosomale Untereinheit angreifen, im Gegensatz zu Ciprofloxacin und Ampicillin als Gyraseinhibitor und Zellwandzerstörer bzw.13. Die antibiotikainduzierte Reduktion von m2A ist bei OG1RF geringer als bei V583 (Abb. 2c), was höchstwahrscheinlich auf die deutlich geringeren Konzentrationen von Erythromycin und Chloramphenicol zurückzuführen ist, die bei OG1RF verwendet werden. Bisher zeigen die Daten, dass die Exposition von E. faecalis gegenüber subinhibitorischen Konzentrationen von Antibiotika, die auf die ribosomale 50-S-Untereinheit abzielen, m2A in 23-S-rRNA und -tRNA selektiv reduziert, was die Frage nach der mechanistischen Grundlage für dieses Epitranskriptomverhalten aufwirft.

OG1RF (a, b) und V583 (c) wurden Antibiotika in Konzentrationen ausgesetzt, die unter ihren minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) lagen, und die Menge an m2A in tRNA und 23 S rRNA wurde mittels LC-MS gemessen. Die m2A-Spiegel sanken für die bakteriostatischen Makrolide Erythromycin (ERY; a–c) und Spiramycin (SPI; b) sowie Chloramphenicol (CAM; a–c), nicht jedoch für das bakterizide Ciprofloxacin (CIP; c), Ampicillin (AMP; c). ) oder die Aminoglykoside Gentamicin (GEN; c) und Kanamycin (KAN; a, b). Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung für n = 4 (c) und n = 3 (a, b) unabhängige Experimente dar. Statistische Analyse mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett-Test im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. NS nicht signifikant; *P < 0,05; **P < 0,005; ***P < 0,0005. a Genaue p-Werte: 0,1 ERY, 0,0036; 0,2 ERY, 0,0020; 0,3 ERY, 0,0022; 0,5 SPI, 0,0003; 1 SPI, 0,0003; 0,8 CAM, 0,0006; 1,6 CAM, 0,0003. b Genaue p-Werte: 0,1 ERY, 0,0005; 0,2 ERY; 0,0006; 0,3 ERY, 0,0007; 0,5 SPI, 0,0064; 1,0 SPI, 0,0008; 0,8 CAM, 0,0071; 1,6 CAM, 0,0022. c Genaue p-Werte: 10 ERY, 0,0149; 30 ERY, 0,0039; 100 ERY, 0,0031; 1,6 CAM, 0,0063; 3,2 CAM, 0,0009.

In Escherichia coli wird die m2A-Bildung durch die RNA-Methyltransferase RlmN katalysiert, die A2503 in 23 S-rRNA am Peptidyltransferase-Zentrum in der 50 S-ribosomalen Untereinheit und A37 in der Untergruppe von tRNAs, die Adenin an dieser Position in der Anticodon-Stammschleife tragen, methyliert11. Da RlmN in E. faecalis bisher nicht charakterisiert wurde, analysierten wir die m2A-Spiegel in einer ΔrlmN-Deletionsmutante in OG1RF und stellten einen vollständigen Verlust der Modifikation in 23 S-rRNA und -tRNA fest (Abb. 3a). Wir fragten zunächst, ob die Reduktion von m2A durch Makrolide und Chloramphenicol eine transkriptionelle oder translationale Regulierung von RlmN beinhaltet. Weder der Gehalt an rlmN-mRNA (qPCR) noch der Gehalt an RlmN-Protein (gezielte Proteomik) wurde durch die Erythromycin-Behandlung signifikant beeinflusst (Abb. 3b, c). Diese Daten legen nahe, dass die Aktivität von RlmN posttranslational durch Antibiotika-Exposition reguliert wurde.

a Der Verlust von rlmN führt zur Abschaffung von m2A in OG1RF (Mittelwert ± SD, n = 2). b RT-qPCR von rlmN in OG1RF und V583 nach Erythromycin-Behandlung. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD für 4 Experimente dar: zwei biologische Replikate, analysiert mit zwei verschiedenen Primersätzen. Statistische Analyse mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett-Test vs. unbehandelt: NS nicht signifikant. c Gezielte Proteomik von RlmN in OG1RF und V583 nach Erythromycin-Behandlung. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD für sechs Experimente dar: drei Peptide, die in zwei unabhängigen Experimenten überwacht wurden. Statistische Analyse mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett-Test vs. unbehandelt: NS nicht signifikant. Verhältnis von m2A zu A in d 23 S-rRNA und e-tRNA mit Menadion-Behandlung. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung für drei unabhängige Experimente dar. Statistische Analyse durch einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett-Test im Vergleich zu unbehandelt: **P < 0,005; ****, P < 0,0001. d Genaue p-Werte: 50 μM, 0,0886; 100 μM, 0,0102; 200 μM, 0,0064. e Genaue p-Werte: 50 μM, 0,0020; 100 μM, 0,0004; 200 μM, 0,0004. f Mittlere Fluoreszenzintensität von CellROX Green Dye+ in OG1RF, behandelt mit Antibiotika in den angegebenen Konzentrationen; MIC minimale Hemmkonzentration. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung für drei unabhängige Experimente dar. Statistische Analyse durch Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett-Test im Vergleich zu EtOH; NS nicht signifikant; P < 0,05, P < 0,005, P < 0,0005 und P < 0,0001 werden als *, **, *** bzw. **** bezeichnet. Genaue p-Werte: ERY 0,2× MIC, 0,0432; ERY 0,4× MIC, 0,0002; ERY 2× MIC, <0,0001; ERY 4× MIC, <0,0001; CAM 0,4× MIC, 0,0043; CAM 2× MIC, <0,0001; CAM 4× MIC, <0,0001; AMP 0,2× MIC, 0,0343; TET 0,4× MIC, 0,0285; TET 2× MIC, <0,0001; TET 4× MIC, 0,0063; Menadion 50 μM, <0,0001; Menadion 100 μM, <0,0001; Menadion 200 μM, <0,0001. g Die Zelltötungskinetik verschiedener Antibiotika bei 10-facher MHK zeigt, dass ROS-erzeugende Antibiotika in OG1RF nicht bakterizid sind. Symbole stellen einzelne Datenpunkte für drei unabhängige Experimente dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. EtOH-Ethanol, ERY-Erythromycin, CAM-Chloramphenicol, STR-Streptomycin, KAN-Kanamycin, AMP-Ampicillin, TET-Tetracyclin, CIP-Ciprofloxacin.

Einer der möglichen Mechanismen zur Regulierung der RlmN-Aktivität ist Antibiotika-induzierter oxidativer Stress. RlmN ist ein radikalisches S-Adenosylmethionin (SAM)-Enzym, das einen [4Fe-4S]-Cluster enthält, der empfindlich gegenüber Störungen durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS)2 ist. Um dieses Modell zu testen, haben wir OG1RF in Gegenwart des Superoxidradikalgenerators Menadion14 in subinhibitorischen Konzentrationen gezüchtet und dann m2A in 23 S rRNA und tRNA gemessen. Die Behandlung mit Menadion verursachte eine dosisabhängige Abnahme von m2A sowohl in rRNA als auch in tRNA (Abb. 3d, e). Dieses Ergebnis impliziert, dass die Makrolide und Chloramphenicol auch ROS in OG1RF und V583 induzierten, was wir mithilfe der fluorogenen Superoxid-spezifischen Sonde CellROX Green untersuchten, um die durch Antibiotika induzierten ROS-Spiegel in OG1RF15 zu quantifizieren. Wie erwartet erhöhten sowohl Erythromycin als auch Chloramphenicol die CellROX Green-Fluoreszenz bei subinhibitorischen und höheren Konzentrationen (Abb. 3f). Angesichts des Einflusses von Antibiotika auf die Form und Größe von Bakterienzellen, der zu Artefakten bei der Interpretation durchflusszytometrischer Analysen von ROS-detektierenden Fluoreszenzfarbstoffen führen kann, und der Bedeutung der Einstellung von FSC- und SSC-Gates16 haben wir bestätigt, dass die Fluoreszenzänderungen auf die Verwendung von ROS zurückzuführen sind ein optimiertes Gating und andere durchflusszytometrische Parameter, die Artefakte bei der farbstoffbasierten ROS-Detektion minimieren (Ergänzende Abbildungen 5, 6)15. Tatsächlich bestätigen zwei Beobachtungen das Fehlen von Größenartefakten. Erstens reduzierte Erythromycin die mittleren FSC-H- und SSC-H-Werte bei subinhibitorischen Konzentrationen (ergänzende Abbildung 6), was auf eine geringere Zellgröße hindeutet, dennoch stieg die mittlere Fluoreszenzintensität von CellROX Green Dye direkt mit der Erythromycin-Konzentration (Abb. 3f). Andererseits verursachte Ampicillin einen Anstieg des mittleren FSC-H und SSC-H (ergänzende Abbildung 6), verursachte jedoch keinen Anstieg der mittleren Fluoreszenzintensität von CellROX Green Dye (Abb. 3f). Diese beiden Beobachtungen zeigen überzeugend, dass Antibiotika-induzierte Veränderungen der Fluoreszenz in den CellROX-Farbstoffstudien auf die ROS-Aktivierung des Farbstoffs und nicht auf Größenartefakte der Durchflusszytometrie zurückzuführen sind. Nicht alle Ribosomen-Targeting-Antibiotika erzeugen ROS in OG1RF. Sub- und suprainhibitorische Konzentrationen von Tetracyclin, das an die 30 S-Untereinheit bindet, induzierten einen Anstieg der CellROX Green-Fluoreszenz, während dies bei den Aminoglykosiden Streptomycin und Kanamycin nicht der Fall war (Abb. 3f). Darüber hinaus erhöhten die mechanistisch unterschiedlichen Ampicillin und Ciprofloxacin die CellROX Green-Fluoreszenz weder bei sub- noch supra-hemmenden Konzentrationen (Abb. 3f). Diese Beobachtungen scheinen im Widerspruch zu Léger et al. zu stehen, die berichteten, dass die β-Lactame Amoxicillin und Cefotaxim durch Reduktion von Demethylmenachinon (DMK) in E. faecalis eine Superoxidproduktion verursachten17. Sie haben jedoch kein intrazelluläres Superoxid gemessen. Es ist allgemein bekannt, dass E. faecalis über nach außen gerichtetes, membrangebundenes DMK hohe Mengen an extrazellulärem Superoxid produziert. Das Superoxid kann jedoch nicht durch die Zellwände diffundieren und wird von CellRox nicht als intrazelluläres Superoxid erkannt und wird auch schnell zu diesem dismutiert Wasserstoffperoxid außerhalb der Zelle18; Léger et al. maßen extrazelluläres Wasserstoffperoxid als Ersatz für Superoxid17. Dass die hier beobachtete RlmN-Aktivität durch eine antibiotikainduzierte Verringerung der SAM-Spiegel verursacht werden könnte, ist nicht möglich, da sich bei anderen Modifikationen auf Methylierungsbasis als m2A keine Änderungen ergeben. Obwohl wir hier die tRNA-Spiegel nicht gemessen haben, bestätigt die Konstanz aller anderen RNA-Modifikationsgrade, dass die Antibiotikabehandlung die Spiegel der rRNA- und tRNA-Substrate von RlmN nicht signifikant verändert hat. Obwohl unsere Studien keinen Beweis für eine direkte Reaktion von ROS mit RlmN liefern, ist die Dosis-Wirkungs-Beziehung für die RlmN-Hemmung mit Menadion- (Abb. 3e), Erythromycin- (Abb. 2c, 3f) und Chloramphenicol-induzierten ROS (Abb 2c, 3f) deutet stark darauf hin, dass RlmN durch intrazelluläres Superoxid inaktiviert wird, das aus der Exposition von E. faecalis gegenüber Makroliden und Chloramphenicol resultiert.

Angesichts des umstrittenen Modells, dass bakterizide Antibiotika einen gemeinsamen Mechanismus zur Erzeugung zytotoxischer ROS15,19,20 haben, haben wir Antibiotika auf ihre bakterizide und bakteriostatische Aktivität in E. faecalis getestet. Erythromycin und Chloramphenicol wurden als bakteriostatisch21 eingestuft, mit bakterizider Wirkung in hohen Konzentrationen gegen Streptococcus pneumoniae21, während Ciprofloxacin, Ampicillin und Streptomycin als bakterizid eingestuft wurden21. Unsere Daten zeigen jedoch, dass Erythromycin und Chloramphenicol bei geringen Konzentrationen in OG1RF die Superoxidproduktion induzieren, während dies bei Ciprofloxacin, Ampicillin und Streptomycin nicht der Fall ist. Léger et al. beobachteten die ROS-Erzeugung durch das verwandte β-Lactam Amoxicillin in übertödlichen Konzentrationen, wiederum durch Messung von Wasserstoffperoxid, das wahrscheinlich aus extrazellulär produziertem Superoxid erzeugt wurde. Um die bakterizide Aktivität festzustellen, führten wir Abtötungstests mit OG1RF in Gegenwart von Antibiotika mit dem Zehnfachen ihrer MHK durch und stellten fest, dass Antibiotika, die die CellROX Green-Fluoreszenz erhöhen (z. B. Erythromycin, Chloramphenicol, Tetracyclin), in OG1RF bakteriostatisch wirken, während Ciprofloxacin, Ampicillin usw Streptomycin, das keine ROS induziert, ist bakterizid (Abb. 3g). Diese Daten widerlegen nicht nur den Zusammenhang zwischen bakteriziden Antibiotika, ROS und Zelltod weiter, sondern werfen auch die Frage nach der Rolle von RlmN bei der Antibiotikaempfindlichkeit von E. faecalis auf.

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkung der RlmN-Aktivität auf die Antibiotikaempfindlichkeit von E. faecalis, indem wir die ΔrlmN-Deletionsmutante und einen Stamm, der RlmN überexprimierte, verwendeten. Hier haben wir eine konstitutive Überexpressionsmutante, OG1RFprlmN, erstellt, die ein RlmN-exprimierendes Plasmid unter dem konstitutiven Sortase A-Promotor im Vektor pGCP12322 trug; und ein Kontrollstamm, OG1RFpEmpty, der das gleiche Plasmid trug, dem die kodierende Sequenz für RlmN fehlte. Eine Überexpression von RlmN hatte keinen Einfluss auf die MHK für Erythromycin, Streptomycin, Kanamycin, Ampicillin, Tetracyclin oder Ciprofloxacin (Ergänzungstabelle 2), erhöhte jedoch die Empfindlichkeit von OG1RFprlmN gegenüber der Abtötung durch die bakteriziden Antibiotika Ampicillin und Ciprofloxacin um das Zehnfache ( Abb. 4a, b). Der Verlust von RlmN hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum von E. faecalis in Gegenwart des bis zu Fünffachen der Wildtyp-MIC für die fünf Antibiotika (Ergänzungstabelle 2, Abb. 4c, d), mit Ausnahme eines 16-fachen Anstieg der MHK für Chloramphenicol (Abb. 4e, Ergänzungstabelle 3). Zusammengenommen erhöht (1) eine Überexpression von RlmN die Empfindlichkeit von E. faecalis gegenüber Ampicillin und Ciprofloxacin und (2) führt der Verlust der RlmN-Aktivität zu einer Resistenz gegen Chloramphenicol, was darauf hindeutet, dass RlmN eine Rolle bei der Regulierung der Antibiotikatoleranz spielen könnte.

Kinetik der Zelltötung für OG1RFpEmpty und OG1RFprlmN, gezüchtet mit 5× MHK für a Ampicillin (5 µg/ml) und b 5 µg/ml Ciprofloxacin. Kinetik der Zelltötung für OG1RF und ΔrlmN, gezüchtet mit 5× MIC für c 5 µg/ml Ampicillin und d 5 µg/ml Ciprofloxacin. Die Grafiken zeigen individuelle Daten für 4 unabhängige Experimente. e Wachstumstest für die minimale Hemmkonzentration (MHK) von Chloramphenicol mit OG1RF und ΔrlmN. Die Grafik zeigt Daten von 4 biologischen Replikaten.

Als nächstes definierten wir die Auswirkungen der RlmN-Aktivität auf das Zellproteom. Unsere Ergebnisse belegen, dass die Methyltransferaseaktivität von RlmN durch Superoxid abgeschwächt wird, was die Möglichkeit erhöht, dass RlmN als Redoxsensor dient, der die Stressreaktion der Zellen reguliert. Um diese Idee zu testen, führten wir quantitative Proteomik unter Verwendung multiplexer isobarer Tandem-Massen-Tags (TMT) durch, um unterschiedlich exprimierte Proteine ​​zwischen OG1RF, ΔrlmN und OG1RF zu identifizieren, die in Menadion gezüchtet wurden (Abb. 5a, b; Ergänzungstabelle 3; Ergänzungsdaten 1). Im Vergleich zu mit Menadion behandeltem OG1RF waren in ΔrlmN nur wenige Proteine ​​hochreguliert, was auf die Präzision von RlmN als molekularer Schalter schließen lässt. Tatsächlich fanden wir eine positive Korrelation von R = 0,900 zwischen statistisch signifikanten (p <0,05) Proteinveränderungen in ΔrlmN und OG1RF, die mit Menadion behandelt wurden (Abb. 5d). Eines davon war das antioxidative Abwehrenzym Superoxiddismutase, für das es in E. faecalis ein einziges Gen (sodA) gibt23. Bemerkenswert ist, dass ein weiteres bekanntes antioxidatives Abwehrenzym, Katalase (KatA), in den Proteomanalysen nicht konsistent nachgewiesen wurde (Supplementary Data 1). Interessanterweise umfasst der gemeinsame Satz von Proteinen, die in beiden Datensätzen herunterreguliert werden, Proteine, die mit Virulenz assoziiert sind (Ergänzungstabelle 4). Das Protein EbpA der Pilus-Untereinheit ist ein wichtiger Virulenzfaktor in E. faecalis, der an der Bildung von Biofilmen, Endokarditis und katheterassoziierten Harnwegsinfektionen beteiligt ist24; und WxL-Domänen enthaltende Proteine25,26, die in Enterococus faecium mit dem Überleben im Gallensalz und der Pathogenese der Endokarditis in Verbindung gebracht werden27.

Vulkandiagramme, die Veränderungen der Proteinspiegel in OG1RF zeigen, die durch einen rlmN-Knockout (ΔrlmN) und eine b-Menadion-Behandlung verursacht werden. Die P-Werte wurden mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests berechnet. Die log2-fache Änderung (x-Achse) wurde gegen den −log10(p-Wert) (y-Achse) aufgetragen. Ein −log10(p-Wert) von 1,30 Schwellenwert (P < 0,05) wird durch die gepunktete horizontale Linie dargestellt, während die vertikalen gepunkteten Linien Fold-Change-Werte bei ±1 SD darstellen. c Proteine, die sowohl in mit Menadion behandeltem als auch in ΔrlmN ohne P-Wert-Grenzwert nachgewiesen wurden. Pearson-Korrelation R = 0,448, zweiseitiger p-Wert < 0,0001. d Proteine, die sich sowohl in mit Menadion behandelten als auch in ΔrlmN-Zellen signifikant veränderten (P < 0,05). Der Cutoff wurde auf 1 SD festgelegt, was einem log2 (fache Änderung) von ±0,639 für die Menadionbehandlung und einem log2 (fache Änderung) von ±0,443 für ΔrlmN entspricht. Blaue Kreise stellen Proteine ​​dar, die in beiden Fällen im Vergleich zu unbehandelten Wildtyp-Zellen deutlich hoch- oder runterreguliert wurden. Diese Proteine ​​sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. Die angezeigten Daten beziehen sich auf drei biologische Replikate. Rote Kreise bezeichnen Superoxiddismutase (SodA). Pearson-Korrelation R = 0,900, zweiseitiger p-Wert 0,0372.

Basierend auf den hier vorgestellten Ergebnissen schlagen wir einen Mechanismus vor (Abb. 6), bei dem RlmN als ROS-empfindlicher molekularer Schalter fungiert, der physiologische Reaktionen auf oxidativen Stress moduliert und phänotypische Resistenz gegen Umweltstress und antimikrobielle Wirkstoffe verleiht. Dies ist angesichts der Bedeutung anderer Fe-S-Proteine ​​wie SoxR, Fnr und Aconitase als ROS-Sensoren, die mit Veränderungen der Genexpression und des Zellphänotyps verbunden sind, vielleicht nicht überraschend6. RlmN und m2A fehlen in Eukaryoten und innerhalb von Prokaryoten ist RlmN das einzige Enzym, das m2A synthetisiert. Die Inertheit des C2 von Adenosin gegenüber elektrophilen Angriffen und die geringe Acidität des C2-Protons erfordern ein freiradikalisches SAM-Zwischenprodukt. Dieser Mechanismus unterscheidet sich deutlich von typischen SAM-abhängigen Methyltransferasen und ist einzigartig für RlmN28 und die Chloramphenicol-Florfenicol-Resistenz-Methyltransferase (Cfr)29. Hier haben wir gezeigt, dass die RlmN-Aktivität nicht nur stark vom intrazellulären Superoxidspiegel abhängt, sondern auch den SodA-Spiegel reguliert, was die Antibiotikatoleranz30 fördert und das Überleben in Makrophagen23 in E. faecalis und anderen Bakterien erleichtert.

Umweltfaktoren sowie bestimmte Antibiotika induzieren bei Enterococcus faecalis reaktive Sauerstoffspezies. Diese führen zur Inaktivierung von RlmN durch Störung seines Fe-S-Clusters, was eine doppelte Wirkung sowohl auf das Ribosom als auch auf die tRNA hat. m2A (rot dargestellt) befindet sich in Position 37 ausgewählter tRNAs und 23 S-rRNA im Peptidyltransferase-Zentrum des Ribosoms. Der Verlust von m2A-Modifikationen an der rRNA und tRNA führt zu einem veränderten Pool an Ribosomen und tRNA, was zu einer Hochregulierung der antioxidativen Reaktion und einer Herabregulierung der Virulenzfaktoren führt, was zu einem verbesserten Überleben in Gegenwart von Antibiotika führt.

Wie führt die Exposition von E. faecalis gegenüber Ribosomen-bindenden Antibiotika zu erhöhten Superoxidwerten? Obwohl es trotz früherer Behauptungen keinen universellen Mechanismus gibt, durch den die Antibiotikaexposition zu einem Anstieg der ROS in Bakterien führt20, gibt es zahlreiche Wege zur Erzeugung von Superoxid und anderen ROS sowie zur Umweltexposition von Bakterien gegenüber ROS2. E. faecalis erzeugt große Mengen an extrazellulärem Superoxid18, wobei Léger et al. Dies zeigt, dass supraletale Ampicillin-Dosen diese Werte erhöhen17. Obwohl wir den extrazellulären ROS nicht gemessen haben, kann Superoxid nicht durch die Bakterienzellwand diffundieren und unsere Ergebnisse zeigen, dass weder sub- noch supraletales Amoxicillin oder andere bakterizide Antibiotika bei E. faecalis eine intrazelluläre Superoxidbildung verursachen (Abb. 3f). Wie subletale Konzentrationen von Erythromycin und Chloramphenicol zu einem Anstieg des Superoxidspiegels führen, könnte mit dem durch die Hemmung der Translation oder Fehltranslation verursachten Zellstress zusammenhängen, wobei der proteotoxische Stress zu einem erhöhten reduktiven Metabolismus und damit zu einem Anstieg des Superoxids führt. Der Mechanismus der Erythromycin-induzierten Superoxidproduktion muss noch weiter untersucht werden.

Welche Rolle spielt RlmN-katalysiertes m2A bei den phänotypischen Veränderungen, die durch den Verlust von RlmN oder die Exposition gegenüber Superoxid verursacht werden? Basierend auf der RlmN-Aktivität sowohl auf rRNA als auch auf tRNA fallen mir zwei Möglichkeiten ein. Aus der rRNA-Perspektive könnte m2A den Ribosomenstopp erleichtern, der zur Aktivierung der ErmB-Expression durch das entstehende ErmBL-Peptid führt31. RlmN katalysiert die m2A-Bildung an A2503 von 23 S-rRNA, einem konservierten Nukleotid, das sich im Peptidyltransferase-Zentrum (PTC) des Ribosoms nahe dem Eingang zum Austrittskanal für das entstehende Polypeptid befindet (Abb. 7) und an der Feinabstimmung beteiligt ist Wechselwirkungen zwischen Ribosom und entstehendem Peptid, die das Verzögerungssignal an den PTC32 weiterleiten. A2503 befindet sich räumlich sehr nahe an der Erythromycin-Bindungsstelle32, dem entstehenden ErmBL-Peptid, das die ErmB-Expression bei der Bindung von Antibiotika aktiviert33, und an A2058, das durch ErmB mit m6A modifiziert wird, um die Bindung von Antibiotika zu verhindern (Abb. 7). Obwohl spekulativ, besteht eine Hypothese darin, dass der Verlust der RlmN-Aktivität m2A2503 reduziert und somit die ErmBL-induzierte Aktivierung der ErmB-Synthese erleichtert.

Die Abbildung umfasst Erythromycin (blau), Chloramphenicol (rosa), die durch RlmN mit m2A modifizierte A2503-Stelle (rote Kugel) und die mit Erm-vermitteltem m6A modifizierte A2058-Stelle (gelbe Kugel).

Aus tRNA-Sicht ist RlmN eine von nur zwei Methyltransferasen, von denen bekannt ist, dass sie sowohl rRNA als auch tRNA11 modifizieren. In E. coli kommt m2A37 in sechs tRNAs vor: tRNAArgICG, tRNAAspQUC, tRNAGlncmnm5sUUG, tRNAGlnCUG, tRNAGlumnm5s2UUC und tRNAHisQUG34. Modifikationen an Position 37 sind wichtig für die Aufrechterhaltung des Leserahmens35, während der Verlust von RlmN den Stop-Codon-Readthrough erhöht36. Letzteres ist für die Synthese von Selenoproteinen in E. faecalis wahrscheinlich nicht relevant, da es im Genom von E. faecalis keine offensichtlichen Gene gibt, die für Selenoproteine ​​kodieren37. Weitere Studien sind im Gange, um festzustellen, ob E. faecalis tRNA-Reprogrammierung und Codon-abhängige Translation nutzt, um die Expression von Stressreaktionsgenen zu regulieren, wie es bei Mykobakterien beobachtet wird7.

Schließlich werfen unsere Ergebnisse die Frage nach der Einzigartigkeit der Empfindlichkeit von RlmN gegenüber der Inaktivierung durch Superoxid im Vergleich zu anderen Fe-S-Clusterproteinen in E. faecalis und anderen Organismen auf. E. faecalis ist unter menschlichen kommensalen und pathogenen Bakterien ungewöhnlich, da ihm viele Fe-S-Clusterproteine ​​wie Fumarase, Aconitase, Isocitratdehydrogenase und Succinatdehydrogenase im Tricarbonsäurezyklus fehlen38. Dieses Fehlen eines Tricarboxylatzyklus ist auch bei Listeria monocytogenes zu beobachten, die ebenfalls mit E. faecalis einen Mangel an ROS-Bildung aufweist, wenn sie bakteriziden Antibiotika ausgesetzt werden39. Weitere Fe-S-Clusterproteine, die in E. faecalis fehlen, sind der GrxD-Eisentransportregulator, eines von drei Systemen für die Fe-S-Cluster-Biogenese (NIF, ISC und SUF; nur SUF ist in E. faecalis vorhanden40) und MiaB. Letzteres wird durch unsere Unfähigkeit bestätigt, m2si6A in Gegenwart von i6A nachzuweisen (Abb. 1d). E. faecalis besitzt jedoch mehrere Fe-S-Clusterproteine, darunter QueE und QueG, die an der Queuosin (Q)-Biosynthese beteiligt sind. Es ist eindeutig mehr Arbeit erforderlich, um die Allgemeingültigkeit von ROS-empfindlichen Fe-S-Cluster-RNA-modifizierenden Proteinen in anderen Organismen und homologen Epitranskriptom-vermittelten Signalnetzwerken zu bestimmen. Es ist durchaus möglich, dass RlmN als potenzieller Redox-Signalknoten in E. faecalis besonders empfindlich ist. Zusätzlich zu MiaB gibt es jedoch andere Fe-S-Cluster enthaltende RNA-modifizierende Enzyme42, die wie RlmN als redoxempfindliche Regulatoren dienen können. Eine systematische Analyse von ROS-empfindlichen RNA-Modifikationen in verschiedenen Mikroben würde unser Verständnis der Reaktionsnetzwerke auf oxidativen Stress in Bakterien verbessern.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die RlmN-Aktivität nicht nur stark vom Superoxidspiegel abhängt, sondern auch den SodA-Spiegel reguliert. Bei E. faecalis und anderen Bakterien fördert SodA die Antibiotikatoleranz30 und erleichtert das Überleben in Makrophagen23. Insgesamt kann RlmN, das in Bakteriengattungen weit verbreitet ist43, als Redoxschalter dienen, der die Redoxerkennung sowohl an das rRNA- als auch das tRNA-Epitranskriptom weiterleitet, um die Translation für eine schützende Reaktion auf oxidativen Stress direkt zu modulieren.

Die Enterococcus faecalis-Stämme OG1RF und V583 werden in tryptischer Sojabrühe (TSB) gezüchtet oder auf tryptischem Soja-Agar unter aeroben Bedingungen bei 37 °C ausplattiert. Alle mutierten Stämme sind Derivate von OG1RF. Der rlmN-Knockout in OG1RF (ΔrlmN) wurde durch eine In-Frame-Deletion von rlmN aus OG1RF durch Allelersatz unter Verwendung des Vektors pGCP21322 erzeugt. Die 250-bp-Regionen stromaufwärts und stromabwärts der kodierenden Sequenz von rlmN wurden aus genomischer OG1RF-DNA amplifiziert und durch überlappende PCR zusammengefügt und in die XhoI/KpnI-Stellen von pGCP213 eingefügt (Ergänzungstabellen 5 und 6). Dieses Plasmid wurde in OG1RF transformiert und durch Rekombinase-vermittelten Genaustausch in die spezifischen Stellen auf dem Chromosom des Elternstamms eingeführt.

Der RlmN-Überexpressor OG1RFprlmN wurde durch die Einführung des für RlmN kodierenden Gens in das Plasmid pGCP123 unter dem konstitutiven Sortase-Promotor22 erzeugt. Die kodierende Sequenz für RlmN wurde mit einem His6-Tag am C-Terminus PCR-amplifiziert und unter einem Sortase-A-Promotor in die XhoI/NotI-Stellen von pGCP123 eingefügt (Ergänzungstabellen 5, 6). OG1RFpEmpty ist OG1RF, das das Plasmid pGCP123 trägt, jedoch ohne Einführung des für RlmN kodierenden Gens. Alle in dieser Studie verwendeten Plasmide sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt. Alle Primer für die Klonierung und RT-qPCR zur Herstellung der Mutantenstämme sind in den Ergänzungstabellen 6 und 7 aufgeführt. Alle Plasmidkonstruktionen wurden durch Sanger-Sequenzierung überprüft. Die für OG1RF verwendeten MHKs sind 1 µg/ml Erythromycin, 1 µg/ml Spiramycin, 4 µg/ml Chloramphenicol, 64 µg/ml Kanamycin, 128 µg/ml Streptomycin, 1 µg/ml Ampicillin, 0,5 µg/ml Tetracyclin und 1 µg/ml. ml Ciprofloxacin. Die für V583 verwendeten MHK-Werte betragen >1024 µg/ml Erythromycin, 8 µg/ml Chloramphenicol, 256 µg/ml Gentamicin, 1 µg/ml Ampicillin und 1 µg/ml Ciprofloxacin. OG1RFprlmN und OG1RFpEmpty werden in 500 µg/ml Kanamycin gezüchtet, um das pGCP123-Plasmid zu erhalten.

Eine Übernachtkultur wurde 1:20-fach verdünnt und dann bei 37 °C gezüchtet, um die mittlere logarithmische Phase zu erreichen. Diese Kultur in der mittleren logarithmischen Phase wurde dann 1:20 in Medien verdünnt, die subletale Konzentrationen an Antibiotika enthielten, und bei 37 °C unter Schütteln mit 180 U/min gezüchtet. Die Kulturen werden mit einer optischen Dichte (OD600) von ~0,6–0,8 nach 4–5 Verdopplungen durch 10-minütige Zentrifugation bei 4000 × g und 4 °C geerntet. Die RNA wurde gemäß Hia et al.44 extrahiert und gereinigt. Kurz gesagt, 100 ml Bakterienkultur wurden in Gegenwart von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol und 100 mM Natriumacetat, pH 5,0, durch Perlenschlagen mit 0,1-mm-Zirkoniumdioxid-Silica-Kügelchen unter Verwendung des Qiagen TissueLyser II für 12 Minuten bei 30 Hz lysiert. Große und kleine RNA-Spezies wurden unterschiedlich mit dem PureLink miRNA Isolation Kit (Invitrogen) mit 35 % Ethanol bzw. 70 % Ethanol gewonnen. 23 S- und 16 S-rRNA werden nach HPLC unter Verwendung der Bio SEC-5-Säule (Agilent; 7,8 mm, Länge: 300 mm, Partikelgröße: 5 μm, Porengröße: 1000 Å) getrennt bis zur Reinheit aus der großen RNA-Fraktion isoliert; und tRNA wurde aus der kleinen RNA-Fraktion nach HPLC auf der Bio SEC-3-Säule (Agilent; 7,8 mm, Länge: 300 mm, Partikelgröße: 5 μm, Porengröße: 300 Å) bis zur Reinheit isoliert. Alle Trennungen wurden mit 100 mM Ammoniumacetat bei 60 °C und einer Flussrate von 0,5 ml/min durchgeführt. Die Elutionsprofile für alle Proben sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt, die hochreine Proben hochwertiger 16 S- und 23 S-rRNAs und tRNAs zeigt. HPLC-Fraktionen, die die Ziel-RNA-Populationen enthielten, wurden kombiniert, konzentriert und einem Pufferaustausch in 10 mM Ammoniumacetat unter Verwendung von 3000 Da Cutoff-Größenausschlussfiltern (Millipore) unterzogen. Die RNA wurde mittels NanoDrop-Spektroskopie quantifiziert.

Zur Quantifizierung von Ribonukleosiden wurde RNA (5 µg) 4 Stunden lang bei 37 °C mit Benzonase (99 % Reinheit, Novagen 70664), bakterieller Phosphatase (ThermoFisher 18011015) und Phosphodiesterase I (Sigma P3243) in Gegenwart von Magnesium enzymatisch hydrolysiert Chlorid, Antioxidantien und Desaminaseinhibitoren, einschließlich Desferroxamin (Sigma D9533), Butylhydroxyltoluol (Sigma W218405), Pentostatin (Sigma SML0508), Tetrahydrouridin (Calbiochem 584222) und interner Standard [15N]5-Desoxyadenosin. Die Proben wurden mit einem 10-kDa-Cutoff-Filter (Nanosep) gereinigt. Die Ribonukleosidmischungen wurden auf einer Hypersil C18-Analysesäule (2,1 × 100 mm, 1,8 mm; Agilent) aufgetrennt, die auf einem Agilent 1290 HPLC-System montiert und mit einem Agilent 6490 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer unter Verwendung mehrerer Reaktionsüberwachung im Positivionenmodus verbunden war. Die verwendeten ESI-Parameter waren Gastemperatur 80 °C; Gasfluss 11 L/min; Verneblerdruck 20 psi; Hüllgastemperatur 300 °C; Kapillarspannung 1800 V; Düsenspannung 2000 V.

Die Ribonukleoside wurden anhand der Retentionszeiten von Standards und MS/MS-Massenübergängen identifiziert, die einen Verlust von entweder Ribose (136 m/z) oder 2'-O-Methyl-Ribose (146 m/z) mit sich brachten (Ergänzungstabelle 1). Zur relativen Quantifizierung von Modifikationen innerhalb derselben Probencharge wird die Signalintensität gegen die kombinierte Intensität der vier kanonischen Ribonukleoside normiert, um Variationen in den RNA-Mengen zu korrigieren. Spektralsignale werden auch gegen einen versetzten internen Standard ([15N]5−2'-Desoxyadenosin) normalisiert, um Schwankungen in der Geräteempfindlichkeit auszugleichen. Zur absoluten Quantifizierung von m2A und Adenosin wurde mit jeder Probencharge eine Reihe von Konzentrationen von Nukleosidstandards für m2A und Adenosin durchgeführt, um Standardkalibrierungskurven zu erhalten. Die Konzentrationen der Nukleoside wurden dann durch Anpassen der Signalintensitäten an die Kalibrierungskurven ermittelt und diese wurden dann verwendet, um das Molverhältnis von m2A/A zu ermitteln.

Die absolute Quantifizierung der m2A-Spiegel in rRNA und tRNA mithilfe von Kalibrierungskurven für Adenosin und m2A zeigt, dass m2A in 23 S-rRNA in einem Verhältnis von etwa 0,00025 m2A pro Adenosin und in einem 2,5-fach höheren Verhältnis von 0,001 in tRNA vorhanden ist. Der Grad der Reduktion von m2A ist bei rRNA und tRNA identisch und nimmt zwischen unbehandelten E. faecalis und Kulturen, die in 100–200 µg/ml Erythromycin gezüchtet wurden, um das Zehnfache ab (Abb. 1c, d). Wir haben die Häufigkeit von m2A in rRNA und tRNA basierend auf 23 S-rRNA mit einer Länge von 2904 Nukleotiden und tRNA mit einer typischen Länge von 76–90 Nukleotiden angenähert, was ~1m2A in 3,6 23 S-rRNAs und ~1 in jeweils 60 tRNAs in unbehandeltem, aerob gezüchtetem V583 entspricht .

Die Gesamt-RNA (2 µg) wurde einer DNA-Entfernung mit dem TURBO DNA-free Kit (Ambion, Life Technologies) gemäß dem Protokoll des Herstellers unterzogen. 600 ng in 15 µl wurden für die reverse Transkription unter Verwendung des iScript cDNA-Synthesekits (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) verwendet. Das Reverse-Transkriptionsprogramm wurde wie folgt durchgeführt: 5 Minuten bei 25 °C, 30 Minuten bei 42 °C und 5 Minuten bei 85 °C, gefolgt von einem Abkühlschritt bei 4 °C. Anschließend wurde eine zweistufige quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qPCR) unter Verwendung des BlitzAmp qPCR-Mastermix (MiRxes, Singapur) durchgeführt. Primersequenzen finden Sie in der Ergänzungstabelle 8. Das qPCR-Programm wurde wie folgt durchgeführt: 5 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 Sekunden und Annealing/Verlängerung bei 60 °C für 30 Sekunden auf a Bio-Rad CFX384 Echtzeit-PCR-Gerät analysiert und mit dem CFX Manager 3.1 analysiert. Für alle Reaktionen wurde eine Schmelzkurvenanalyse bestehend aus 0,5 °C-Schritten von 65 bis 95 °C durchgeführt, um die Spezifität der Primer zu ermitteln. RpoA diente als interne Ladekontrolle.

Da wir RlmN in den quantitativen TMT-Proteomics-Analysen nicht nachweisen konnten, führten wir gezielte Proteomics durch, um RlmN zu quantifizieren. Bakterienpellets aus 10 ml einer logarithmischen Phasenkultur von OG1RF und V583 wurden in 250 µl 50 mM Hepes pH 8, 8 M Harnstoff, 1 mM DTT resuspendiert und durch Perlenschlagen homogenisiert, gefolgt von einer Klärung durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 30 Minuten min. bei 4 °C. Nach der Quantifizierung des Gesamtproteins im Überstand mithilfe des Bicinchoninsäure-Proteintests (ThermoFisher Scientific) wurden 50 µg Protein mit SDS-PAGE-Beladungsfarbstoff gemischt und auf einem 14 %igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Nach dem Färben und Entfärben wurde ein Gelschnitt mit 30–45 kDa, der das Zielprotein RlmN mit 40,9 kDa und die Referenzproteine ​​RpoA mit 35,05 kDa und Gap2 mit 35,77 kDa umfasste, herausgeschnitten und in 1–2 mm große Stücke geschnitten (ergänzende Abbildung 4). Die Gelstücke wurden entfärbt, reduziert und alkyliert, gefolgt von einem Trypsinverdau über Nacht und einer Peptidextraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers (In-Gel Tryptic Digestion Kit, ThermoFisher Scientific). Extrahierte Peptide wurden vakuumgetrocknet und in 2 % Acetonitril in 0,1 % Ameisensäure in Wasser erneut gelöst.

Eine gezielte Quantifizierung von RlmN wurde dann erreicht, indem zunächst Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) verwendet wurde, um Vorläuferpeptide und Übergänge für RlmN und die Referenzproteine ​​RpoA und Gap2 zu identifizieren (Ergänzungstabelle 8). Wir analysierten die Proteinsequenzen von OG1RF RlmN, RpoA und Gap2 vor dem Hintergrund des OG1RF-Proteoms und suchten nach Peptiden mit einer Länge von 8–14 Aminosäuren und den folgenden Skyline-Einstellungen: (1) Trypsinspaltung; (2) Mindestlänge 7 Aminosäuren, Höchstlänge 25 Aminosäuren, ausgenommen 25 N-terminale Aminosäuren; (3) ausgenommen Peptide, die Cys, Met, His, NXT/NXS, RP/KP enthalten; (4) einschließlich möglicher struktureller Modifikationen (z. B. Carbamidomethyl); und (5) maximale variable Modifikationen bei 3 und maximale neutrale Verluste bei 1. Für RlmN identifizierte Skyline 3 Zielpeptide: (1) K.QVIVQEAQDGTVK.Y [67, 79], (2) K.YLFELPDK.N [80, 87] und (3) K.GLAIGAR.H [184, 190], wobei die Peptide Nr. 1 und Nr. 2 ausgewählt wurden. Für Gap2 identifizierte Skyline 5 Zielpeptide: (1) K.YDTTQGR.F [46, 52], (2) K.AIGLVIPELNGK.L [215, 226], (3) K.LDGAAQR.V [227, 233] , (4) R.VPVATGSLTELVTVLDK.E [234, 250] und (5) R.TLEYFANL.- [325, 332], wobei Peptid Nr. 2 ausgewählt wurde. Für RpoA identifizierte Skyline zwei Zielpeptide: (1) R.EDVTQIILNIK.G [70, 80] und (2) K.LYAEEEK.T [86, 92], wobei Peptid Nr. 1 ausgewählt wurde. Ausgewählte Peptide wurden mit einer Reinheit von 90 % synthetisiert und mittels LC-MS/MS auf einer Hypersil C18-Analysesäule (2,1 × 100 mm, 1,8 mm; Agilent), montiert auf einem Agilent 1290 Infinity LC-System, gekoppelt mit einem Agilent 6490 QQQ-Spektrometer, positiv analysiert -Ionenmodus. Der Agilent Automated MRM Method Optimizer for Peptides wurde zur Optimierung der Kollisionsenergien und Fragmentierungsspannungen für ihre MRM-Übergänge verwendet und Peptide wurden in einer Konzentration von 10 µg/ml zur Bestimmung der Retentionszeiten verwendet. Die Umkehrphasenchromatographie wurde mit einer festen Flussrate von 0,25 ml/min mit einem Gradienten aus Wasser und Acetonitril (Lösungsmittel B), angesäuert mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure, durchgeführt. Die verwendeten Gradienten waren wie folgt: 0–29 % Lösungsmittel B von 0–29 Min., 29–90 % von 29–30 Min., 90 % für 38 Min., 90 bis 0 % von 38 bis 39 Min. und 0 % für 45 Min . Quellenbedingungen: Gastemperatur 325 °C, Gasfluss 10 l/min, Zerstäuber 32 psi, Hüllgastemperatur 300 °C, Hüllgasfluss 11 l/min, Kapillare 2000 V, Aufladung 500 V. Säulen wurden bei 40 °C inkubiert . Die beiden besten Vorläuferpeptide nach Peakfläche und Anzahl der Übergänge (mindestens 2) wurden als Qualifizierungs- und Quantifizierungsionen ausgewählt. Nach der Definition der analytischen Parameter für die synthetischen Peptide wurden die aus den Gelscheiben extrahierten Peptide anschließend auf demselben LC-MS/MS-System analysiert. Die Signalintensitäten für jedes Peptid wurden auf die Gesamtsignalintensität für den LC-MS/MS-Lauf normalisiert, um Peptidbeladungsunterschiede zu berücksichtigen, und die Fold-Change-Daten wurden berechnet, indem die normalisierten Signalintensitäten für mit Antibiotika behandelte Proben durch die in Kontrollproben dividiert wurden.

CellROX Green (ThermoFisher) ist ein proprietärer oxidationsempfindlicher Farbstoff, dessen Fluoreszenz bei 500–550 nm nach Anregung bei 488 nm bei Oxidation in Gegenwart von dsDNA erheblich zunimmt. Cellrox Green reagiert auf Hydroxylradikale und Superoxide, jedoch nicht auf Wasserstoffperoxid15. Log-Phase-Kulturen wurden in 10 % TSB in Gegenwart von Menadion oder Antibiotika auf eine OD600 von 0,1 verdünnt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von CellROX Green (endgültige 0,5 µM) für weitere 30 Minuten bei 37 °C C im Dunkeln unter Schütteln bei 180 U/min. Die Proben wurden mit einem HTS-Autosamplersystem auf dem Attune Nxt v4.2.0 (ThermoFisher Scientific) analysiert und die Flussrate wurde auf 25 µL/min mit einem Injektionsvolumen von 30 µL eingestellt. Die Proben wurden mit einer 530/30-nm-Bandpassemission erfasst und 50.000 Ereignisse im Bakterientor aufgezeichnet. Das Gating wurde unter Verwendung ungefärbter Proben für die Bakterienpopulation durch Vorwärtsstreuung (FSC; korreliert mit der Zellgröße) und Seitenstreuung (SSC; korreliert mit der zellinternen Körnigkeit) des Lichts eingestellt, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Die Daten wurden mit der Attune Nxt-Software analysiert.

Frische Kulturen in der mittleren logarithmischen Phase (OD600 von 0,6) wurden mit oder ohne Behandlung 1:20 in TSB-Medium verdünnt und bei 37 °C unter Schütteln bei 180 U/min gezüchtet. Die Kulturen werden mit einer optischen Dichte (OD600) von ~0,6–0,8 nach 4–5 Verdopplungen durch 10-minütige Zentrifugation bei 4000 × g und 4 °C geerntet. Bakterienpellets wurden in 250 µl 50 mM Hepes pH 8, 8 M Harnstoff, 1 mM DTT resuspendiert und durch Perlenschlagen homogenisiert, gefolgt von einer Klärung durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C. Nach der Proteinquantifizierung im Überstand mithilfe des Bicinchoninsäure-Proteintests (ThermoFisher Scientific) wurden 200 µg Protein mit Trypsin verdaut, nachdem es mit DTT reduziert und mit Iodacetamid alkyliert wurde. Nach dreimaligem Waschen mit 0,5 M TEAB und anschließender Fraktionierung mit dem 10-kDa-Ultrafiltrationssystem wurden ~100 μg verdaute Peptide aus jeder Gruppe, einschließlich zweier biologischer Replikate, mit dem Six-Plex-TMT-Kit zur isobaren und isotopischen Massenmarkierung (ThermoFisher) markiert Wissenschaftlich), die gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt wurde.

Die Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Thermo Easy nLC1000) unter Verwendung einer Vorsäule (hausgemacht, 6 cm von 10 µm C18) und einer selbstgepackten analytischen Säule mit 5 µm Spitze (15 cm von 5 µm C18, New Objective) über a getrennt 150-minütiger Gradient vor dem Nanoelektrospray mit einem QExactive-Massenspektrometer (ThermoFisher). Das Massenspektrometer wurde in einem datenabhängigen Modus betrieben. Die Parameter für das vollständige Scan-MS waren wie folgt: Auflösung von 70.000 über 350–2000 m/z, AGC 3e6 und maximale IT 50 ms. Dem vollständigen MS-Scan folgte in jedem Zyklus ein MS/MS für die 15 besten Vorläuferionen mit einem NCE von 28 und einem dynamischen Ausschluss von 30 s. Rohe Massenspektraldatendateien (.raw) wurden mit Proteome Discoverer (ThermoFisher) und Sequest durchsucht. Die Suchparameter waren wie folgt: 10 ppm Massentoleranz für Vorläuferionen; 0,8 Da für Fragmentionen-Massentoleranz; 2 verpasste Spaltungen von Trypsin; Die feste Modifikation war die Carbamidomethylierung von Cystein sowie die N-Term- und Lysin-TMT-Markierung. Variable Modifikationen waren Methioninoxidation und Serin-, Threonin- und Tyrosinphosphorylierung. In die Datenanalyse wurden nur Peptide mit einem Scorer-Score ≥2, einer Reporterkanalintensität >500 und einer Isolationsinterferenz ≤30 einbezogen. Proteomics-Daten sind in den Zusatzdaten 1 dargestellt.

Eine logarithmische Phasenkultur von OG1RF wurde in Tryptic Soy Broth in Gegenwart von Antibiotika bei 37 °C unter Schütteln auf eine Endkonzentration von 108 KBE/ml (OD600 ~ 0,1) verdünnt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots aus den jeweiligen Röhrchen entnommen und seriell bis zum 10-8-fachen verdünnt. Ein Aliquot (2,5 µL) jeder Verdünnung wurde auf TSB-Agar getupft und über Nacht bei 37 °C inkubiert, wobei die Kolonien 24 Stunden nach dem Spotten gezählt wurden.

Zweifache Reihenverdünnungen von Antibiotika in TSB wurden in separaten Reihen einer Polystyrolplatte mit 96 Vertiefungen (Corning) durchgeführt, wobei jede Platte ein Inokulum der jeweiligen Bakterien enthielt. Das Inokulum war eine 1:500-Verdünnung einer Kultur in der logarithmischen Phase (OD600 = 0,5), die bei 37 °C gezüchtet wurde. Die Platte wurde unter Schütteln bei 37 °C inkubiert und die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessen (BIOTEK, Synergy 4). Als MHK-Werte wurden die niedrigste Konzentration angenommen, bei der nach 24 Stunden kein Wachstum erkennbar war (<0,05 OD600). Alle Tests wurden dreimal unabhängig voneinander mit jeweils zwei Proben durchgeführt. MIC-Daten sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Die OG1RF-Stämme wurden in TSB bei 37 °C etwa 16 Stunden lang unter Schütteln (180 U/min) aerob kultiviert, gefolgt von einer 1:20-Verdünnung und bis zum mittleren logarithmischen Wachstum kultiviert. Die Stämme OG1RFpEmpty und OG1RFprlmN, die pGCP123-Plasmide beherbergen, wurden in 500 µg/ml Kanamycin gezüchtet. Die Mid-Log-Kultur wurde auf OD600 ~ 0,06 (~5 × 107 KBE/ml) verdünnt. Ein Aliquot wurde ausplattiert, um die koloniebildenden Einheiten (KBE) (Zeitpunkt 0) vor der Zugabe von Antibiotika mit Endkonzentrationen von 20 µg/ml Ciprofloxacin und 20 µg/ml Ampicillin zu zählen. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde ein Aliquot entnommen und mit sterilem PBS gewaschen. Die Zellen wurden seriell verdünnt und auf tryptischem Soja-Agar ausplattiert, um die Überlebenden zu zählen.

Die statistische Signifikanz wurde anhand geeigneter Tests mit der Software Prism 8 (GraphPad) bewertet, die in den jeweiligen Abbildungslegenden detailliert beschrieben sind. Sternchen geben den Grad der statistischen Signifikanz an: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit dem Zugangscode PXD038178 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Die zur Erstellung von Diagrammen verwendeten Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Autoren danken Dr. Michael DeMott für seine Unterstützung bei der Proteomik-Arbeit. Diese Forschung wurde von der National Research Foundation, Büro des Premierministers, Singapur, im Rahmen ihres Programms Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) durch die Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Interdisciplinary Research Group unterstützt. Wir danken dem NMRC OFIRG20nov-0079 für die finanzielle Unterstützung. Die Beiträge des LNL wurden von der National Research Foundation und dem Bildungsministerium Singapur im Rahmen seines Research Centre of Excellence-Programms am SCELSE unterstützt. AS und JL danken der Singapore‐MIT Alliance (SMA) Graduate Fellowship und dem MOE Tier 2 Grant MOE2018-T2-2-13 für ihre Unterstützung. Proteomics-Arbeiten wurden teilweise im MIT Center for Environmental Health Sciences Bioanalytical Core durchgeführt, das durch das Center Grant P30-ES002109 des National Institute of Environmental Health Sciences mit Hilfe von Dr. Michael Demott unterstützt wird.

Ameya Sinha

Present address: Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH, Inhoffenstraße 7, 38124, Braunschweig, Germany

Ling Ning Lam

Aktuelle Adresse: Department of Oral Biology, University of Florida College of Dentistry, Gainesville, FL, USA

Jiaqi Liang

Aktuelle Adresse: School of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, College of Engineering, Nanyang Technological University, Singapur, Singapur

Cheryl Siew Choo Chan

Aktuelle Adresse: Critical Analytics for Manufacturing Personalized-Medicine IRG, Singapur MIT Alliance for Research and Technology, Singapur, Singapur

Antimikrobielle Resistenz IRG, Singapur MIT Alliance for Research and Technology, Singapur, Singapur

Wei Lin Lee, Ameya Sinha, Hooi Linn Loo, Jiaqi Liang, Peiying Ho, Liang Cui, Cheryl Siew Choo Chan, Kimberly Ann Kline und Peter Dedon

School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapur, Singapur

Ameya Sinha, Ling Ning Lam und Kimberly Ann Kline

Singapore Centre for Environmental Life Sciences Engineering, Nanyang Technological University, Singapur, Singapur

Ling Ning Lam und Kimberly Ann Kline

Abteilung für Biowissenschaften und RNA-Institut, Universität Albany, Albany, NY, USA

Thomas Begley

Abteilung für Mikrobiologie und Molekulare Medizin, Medizinische Fakultät, Universität Genf, Genf, Schweiz

Kimberly Ann Kline

Abteilung für Biotechnik, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Peter Dedon

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WLL, KAK und PD konzipierten Forschung; WLL, AS, LNL, HLL, JL, PH und LC führten Untersuchungen durch; CSCC und TB steuerten neue Reagenzien/Analysewerkzeuge bei; WLL, AS, TB, KAK und PD analysierten die Daten, alle Autoren waren an der Erstellung des Manuskripts beteiligt.

Korrespondenz mit Peter Dedon.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lee, WL, Sinha, A., Lam, LN et al. Ein RNA-Modifikationsenzym erkennt direkt reaktive Sauerstoffspezies für die Translationsregulation in Enterococcus faecalis. Nat Commun 14, 4093 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39790-x

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Eingegangen: 28. Oktober 2022

Angenommen: 27. Juni 2023

Veröffentlicht: 11. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39790-x

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