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Jun 18, 2023

Hefe, der das Sterol C fehlt

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13617 (2023) Diesen Artikel zitieren 179 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Escin ist eine Mischung aus über 30 glykosylierten Triterpenoid (Saponin)-Strukturen,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13617 (2023) Diesen Artikel zitieren

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1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Escin ist eine Mischung aus über 30 glykosylierten Triterpenoid (Saponin)-Strukturen, die aus den getrockneten Früchten der Rosskastanie gewonnen werden. Escin wird derzeit als entzündungshemmendes Mittel eingesetzt und hat potenzielle Anwendungen bei der Behandlung von Arthritis und Krebs. Technisch hergestellte Hefe würde die Produktion spezifischer bioaktiver Bestandteile von Aescin im industriellen Maßstab ermöglichen, allerdings hat sich gezeigt, dass viele Saponine für Hefen toxisch sind. Hier berichten wir, dass ein Saccharomyces cerevisiae-Stamm, dem speziell das Sterol-C-5-Desaturase-Gen ERG3 fehlt, eine auffallend erhöhte Toleranz gegenüber der Aescin-Behandlung aufweist. Transkriptomanalysen sowie das Vormischen von Escin mit Sterolen stützen die Hypothese, dass Escin direkt mit Ergosterol interagiert, jedoch nicht so stark mit den veränderten Sterinen, die in erg3Δ vorhanden sind. Eine Vielzahl von Saponinen ist von kommerziellem Interesse, und diese Forschung unterstreicht den Wert des Screenings von Lipidommutanten, um geeignete Wirte für die technische Produktion von Saponinen zu identifizieren.

Saponine (glykosylierte Triterpenoide) gehören zu den zahlreichsten und vielfältigsten Gruppen pflanzlicher Naturstoffe mit großem Potenzial in vielen Branchen1,2. Neben pharmazeutischen Anwendungen als Impfstoffhilfsstoffe3 und Entzündungshemmer4 haben Saponine auch Potenzial für Therapeutika gegen Arthritis, Fettleibigkeit, Krebs und Alzheimer-Krankheit5,6,7. Einige Saponine werden auch als Schaumstabilisatoren und Emulgatoren in Kosmetika und Seifen verwendet8. Viele Saponinverbindungen haben hämolytische Eigenschaften, und in der Natur wird Saponinen im Allgemeinen eine Funktion als pflanzliche Abwehrstoffe zugeschrieben, obwohl nur wenige Studien den Grad und Mechanismus der antimykotischen Aktivität untersucht haben9,10,11,12,13,14,15,16. Dies ist von Bedeutung für das Verständnis der biologischen Rolle von Saponinen in Pflanzen und für die Entwicklung von Hefen als Fabriken für die Saponinproduktion. Während die Extraktion von Saponin aus Pflanzen saisonabhängig ist und eine begrenzte Ausbeute aufweist, kann Hefe leicht so manipuliert werden, dass sie Pflanzengene exprimiert, und es gibt eine etablierte Infrastruktur für eine schnelle Hefekultur und Produktextraktion im großen Maßstab. Im Gegensatz zu Bakterien verfügen Hefen über ein endoplasmatisches Retikulum (ER), das die Aktivität von ER-lokalisierten Cytochrom-P450-Enzymen unterstützt, die an der Saponin-Biosynthese beteiligt sind. Die Produktion in künstlicher Hefe ermöglicht im Gegensatz zu Saponinmischungen, die aus Pflanzen extrahiert werden, auch die Herstellung und Extraktion gezielter Saponinstrukturen in hoher Reinheit.

Escin (auch Aescin genannt) ist eine Mischung aus über 30 Saponinstrukturen, die aus Früchten des Rosskastanienbaums Aesculus hippocastanum L. extrahiert werden. Ungefähr 60 % des Escins sind β-Escin (Abb. 1a), das aus einem Protoaescigenin-Triterpenoid-Rückgrat besteht, das am verestert ist C-22-Position mit Essigsäure und an der C-21-Position mit Angelsäure oder Tiglinsäure17. Escin hat starke entzündungshemmende Eigenschaften und wird zur Behandlung von chronischer Veneninsuffizienz, postoperativen Ödemen und Hämorrhoiden eingesetzt4,18,19. Escin ist auch bei der Behandlung von Arthritis20,21 und Krebs vielversprechend; Escin stört den Tumorzellzyklus, induziert die Apoptose von Krebszellen, hemmt die Zellmigration und verstärkt die Wirkung von Chemotherapeutika22. Während Rosskastanie eine saisonale Versorgung mit einer Mischung aus Saponinen liefert, könnte künstliche Hefe möglicherweise die ganzjährige Herstellung spezifischer aktiver Komponenten dieses wirksamen Therapeutikums im industriellen Maßstab ermöglichen. Es wurde jedoch zuvor gezeigt, dass Aescin eine antimykotische Wirkung hat23,24.

(a) Struktur von β-Escin, das etwa 60 % der Saponine in Escin ausmacht17. Das Protoaescigenin-Rückgrat ist an C-22 mit Essigsäure und an C-21 entweder mit Engelsäure oder Tiglinsäure verestert (Tiglinsäure abgebildet). Glucuronsäure (GlcA) ist an C-3 konjugiert. An die Glucuronsäure sind zwei Glukosezucker (Glc) gebunden, von denen einer durch Xylose (Xyl) ersetzt werden kann. (b) Aktivität von Enzymen, die an den späteren Stadien der Ergosterol-Biosynthese beteiligt sind, ausgehend vom Vorläufer Zymosterol. Die Reaktionen sind in Abb. S1 dargestellt. (c) Wachstum in Mikrotiterplattenkulturen, angezeigt durch ΔA595 (0–24 h). Drei biologische Replikate ± Standardabweichung (SD).

Von vielen Saponinen, einschließlich Aescin, wurde berichtet, dass sie mit dem Sterolcholesterin von Säugetieren interagieren9,17,25. Wir stellten die Hypothese auf, dass Escin das Pilzwachstum durch Wechselwirkung mit Ergosterol hemmen könnte, das 12 Mol-% des Lipidoms von S. cerevisiae ausmacht und das vorherrschende Sterin an der Plasmamembran der Hefe ist26,27. Dies wird dadurch unterstützt, dass kürzlich gezeigt wurde, dass die Ergänzung der Leptosphaeria maculans-Kultur mit Ergosterol die durch die Aescin-Behandlung verursachte Wachstumshemmung lindert24. Wir stellten außerdem die Hypothese auf, dass Hefestämme, die andere Sterole als Ergosterin anreichern, möglicherweise eine erhöhte Aescin-Toleranz aufweisen. Hier berichten wir, dass ein S. cerevisiae-Stamm, dem die Sterol-C-5-Desaturase Erg3 fehlt, eine auffallend erhöhte Toleranz gegenüber hohen Escin-Konzentrationen aufweist, was unsere Hypothesen stützt. Daher würde ein manipulierter Stamm, dem Erg3 fehlt, die mikrobielle Produktion von Escin-Saponinen ermöglichen.

Wir stellten die Hypothese auf, dass, wenn die Aescin-Toxizität durch direkte Wechselwirkung mit Ergosterol vermittelt wird, die Mutanten der Ergosterol-Biosynthese sich in der Aescin-Toleranz unterscheiden könnten. Es wird angenommen, dass Sterole eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Plasmamembrandynamik spielen28, jedoch sind Hefestämme, denen Enzyme fehlen, die die letzten fünf Schritte der Ergosterinbiosynthese katalysieren (Erg2, Erg3, Erg4, Erg5 oder Erg6; Abb. 1b und S1), lebensfähig. Aufgrund der Substrat-Promiskuität der letztgenannten Enzyme in der Ergosterin-Biosynthese akkumulieren diese Deletionsmutanten eine Mischung von Sterol-Strukturen, die sich von Ergosterin in der Anzahl und Position der Doppelbindungen im Sterol-B-Ring und der Sterol-Seitenkette unterscheiden29. Wir verwendeten Mikrotiterplattenkulturen des Wildtypstamms BY4741 (WT) und Mutanten aus der Yeast Deletion Collection30, um das Wachstum der Ergosterol-Biosynthesemutanten in komplexem reichhaltigem Medium (YPD) in Gegenwart und Abwesenheit von Escin zu beurteilen (Abb. 1c). Die Sterolextraktion und die Analyse mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie bestätigten, dass sich Ergosterol in den Mutantenstämmen nicht anreicherte (Abb. S2 und S3). Die minimale Hemmkonzentration (MHK) von Escin für den WT-Stamm im YPD-Medium betrug 150 µg/ml. Ähnliche MHK-Werte wurden für die Stämme erg2Δ, erg4Δ, erg5Δ und erg6Δ beobachtet, das Wachstum des Stammes erg3Δ war jedoch bis zur höchsten getesteten Konzentration (1000 µg/ml; Abb. S4) ungehemmt.

Um den Einfluss von Escin auf WT-Zellen und den Mechanismus der Escin-Toleranz bei erg3Δ weiter zu untersuchen, analysierten wir die Transkriptome von WT-, erg3Δ- und erg6Δ-Zellen, die 1 Stunde lang mit 0 oder 100 µg/ml Escin in YPD behandelt wurden Kulturen in Flaschen schütteln. Der erg6Δ-Stamm wurde in dieses Experiment einbezogen, da dieser Stamm viele ähnliche Phänotypen mit erg3Δ29 aufweist, aber keine erhöhte Escin-Toleranz aufweist (MHK 150 µg/ml; Abb. 1c). Im Rahmen dieses Experiments analysierten wir auch die Transkriptome von erg3Δ- und erg6Δ-Zellen, die 1 Stunde lang mit 75 µg/ml Escin behandelt wurden.

K bedeutet, dass die Clusterbildung der 2000 Gene mit den variabelsten Expressionsniveaus in Abb. S5 dargestellt ist. Die vollständigen Einzelheiten zur Gen-Set-Anreicherungsanalyse sind in den Zusatzinformationen (SI) enthalten. Cluster-B-Gene (n = 82) werden im Allgemeinen in erg3Δ und erg6Δ im Vergleich zu WT unter allen Bedingungen stärker exprimiert, und wie erwartet ist dieser Cluster mit Genen angereichert, die sich auf Sterolbiosynthese, Steroltransport, Siderophortransport und Regulation beziehen der Transkription durch Glucose. Cluster-A-Gene (n = 821) werden in WT und erg6Δ als Reaktion auf die Aescin-Behandlung herunterreguliert. Dieser Cluster ist mit Genen angereichert, die mit der Ribosomenbiogenese und der RNA-Verarbeitung in Zusammenhang stehen. Die Gene von Cluster C (n = 897) und D (n = 200) sind im Allgemeinen in WT und erg6Δ als Reaktion auf die Aescin-Behandlung hochreguliert, wobei die Gene von Cluster D stärker hochreguliert sind als Cluster C. Cluster D ist an Genen angereichert, die sich auf Folgendes beziehen Trehalose-, Mannose-, Fruktose- und Glutamatstoffwechsel sowie Glykolyse und Zellwandorganisation. Cluster D ist außerdem reich an Genen, die mit Reaktionen auf osmotischen, oxidativen, Temperatur- und Hungerstress in Zusammenhang stehen. Cluster C ist reich an Genen, die sich auf die späte Nukleophagie, den Lipidkatabolismus, die Schwefelassimilation, den Tricarbonsäurezyklus und die Gluconeogenese beziehen.

Differentiell exprimierte Gene (DEGs) mit ≥ 2-facher differentieller Expression zwischen den interessierenden Bedingungen (Abb. 2) werden im Folgenden ausführlicher besprochen, mit vollständigen Details zur Anreicherung des Gensatzes in SI.

Venn-Diagramme für differentiell exprimierte Gene (DEGs). DEGs haben eine ≥ 2-fache Differenzialexpression und eine False Discovery Rate (FDR) ≤ 0,1.

Der Vergleich der Transkriptome von Stämmen unter Kontrollbedingungen zeigt interessante Unterschiede zwischen den Mutantenstämmen und WT. Die Löschung von ERG6 führt zu einer größeren Anzahl von DEGs (n = 162) als die Löschung von ERG3 (n = 106). In beiden Mutanten sind hochregulierte DEGs mit Genen angereichert, die mit der Sterolbiosynthese und dem Steroltransport zusammenhängen, einschließlich des Sterolsensors und des Transkriptionsaktivators UPC2 (Abb. S6). Im Gegensatz dazu ist nur eine sehr kleine Anzahl von Genen, die an der Sphingolipid- und Phospholipidversorgung beteiligt sind, hochreguliert (YSR3, RSB1, FAA2 und ELO2 in beiden Stämmen und zusätzlich SUR1 in erg6Δ; Abb. S7), obwohl über große Veränderungen in der Sphingolipidzusammensetzung berichtet wurde für Sterol-Biosynthese-Mutanten31.

Auch die Mannoprotein-Gene der anaeroben Reaktion der Zellwand sind in beiden Stämmen stark hochreguliert (Abb. S8). Mehrere Schritte der Ergosterin-Biosynthese erfordern Sauerstoff und Eisen als Cofaktoren, und es besteht eine komplexe Wechselwirkung zwischen den regulatorischen Reaktionen auf Ergosterin, Sauerstoff und Eisen32,33,34,35. Eine Reihe von Eisenmangel-Reaktionsgenen36 sind in erg6Δ (FIT2, FIT3, ARN2, SIT1, TIS11), jedoch nicht in erg3Δ, im Vergleich zu WT hochreguliert (Abb. 3a). Kürzlich wurde berichtet, dass sich der eisenempfindliche Transkriptionsfaktor Aft1, der normalerweise zwischen Zytoplasma und Zellkern pendelt, in den Vakuolen von Ergosterin-verminderten upc2Δ-Zellen ansammelt37. Unsere Daten deuten darauf hin, dass dieser Signalweg in erg6Δ und erg3Δ in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst werden kann.

Der erg6Δ-Stamm zeigt eine erhöhte Expression von Schwefelassimilationsgenen und Eisenmangelreaktionsgenen. Die Expression von Genen, die sich auf (a) Eisenhomöostase und (b) den Methionin-Biosyntheseweg beziehen, beträgt unter Kontrollbedingungen log2-Einheiten (CPM + 4). Deutlich; Gen hochreguliert ≥ 2-fach in erg6Δ im Vergleich zu WT. Sternchen; Gen hochreguliert ≥ 2-fach in erg3Δ im Vergleich zu WT (FDR ≤ 0,1).

Methioninstoffwechselgene sind auch in erg6Δ hochreguliert, nicht jedoch in erg3Δ (Abb. 3b). Insbesondere sind die hochregulierten Gene mit dem Schwefelassimilationsweg (SUL2, MET3, MET14, MET16, MET5, MET10) und dem Methylzyklus (MET6, SAM2, MHT1) verbunden, der S-Adenosylmethionin (SAM) erzeugt (Abb. S9). . Das Erg6-Enzym nutzt den Methyldonor SAM, um Zymosterol zu methylieren38, und es wurde zuvor festgestellt, dass ein Erg6-defizienter Stamm SAM ansammelt, was auf einen verringerten SAM-Verbrauch zurückgeführt wurde39.

Beide Stämme regulieren eine Reihe von Genen herunter, die an der Paarung beteiligt sind (Abb. 4). Hierbei handelt es sich hauptsächlich um Gene, die an der Konjugation zwischen sich paarenden Schmoo-Spitzen beteiligt sind (FUS1, AGA1, AGA2, FIG1, SHC1), und eine deutlich verringerte Paarungseffizienz wurde zuvor für Ergosterol-Biosynthesemutanten beschrieben40,41.

Die Stämme erg3Δ und erg6Δ zeigen eine verringerte Expression von Paarungsgenen. Expression von Paarungsgenen, Einheiten log2(CPM + 4). Deutlich; im Vergleich erg6Δ 0 µg/ml Escin gegenüber WT 0 µg/ml Escin um ≥ 2-fach herunterreguliert. Sternchen; in den Vergleichen erg3Δ 0 µg/ml Escin mit WT 0 µg/ml Escin um das ≥ 2-fache herunterreguliert (FDR ≤ 0,1).

Beide Stämme exprimieren NCE102 auch in geringerem Maße als WT (42 % des WT-Spiegels in erg3Δ und 40 % des WT-Spiegels in erg6Δ). Obwohl Nce102 hauptsächlich an Plasmamembran-Eisosomen lokalisiert ist, wurde kürzlich berichtet, dass es eine Rolle bei der Vakuolenfusion spielt,42 und Vakuolen sind in vielen Mutantenstämmen der Ergosterol-Biosynthese stark fragmentiert, einschließlich erg3Δ, jedoch nicht erg6Δ43,44,45.

Es ist bemerkenswert, dass mehrere DEGs zwischen den Mutanten und WT eine unbekannte Funktion haben; 20 und 29 hochregulierte DEGs und 10 und 13 herunterregulierte DEGs in erg3Δ bzw. erg6Δ.

Als Reaktion auf 100 µg/ml Escin regulieren die Stämme WT und erg6Δ die Gene 473 bzw. 494 hoch (Abb. 2b). Diese DEGs sind mit Genen angereichert, die auch mit Reaktionen auf Austrocknung, osmotischen Stress, oxidativen Stress, Temperatur, chemische Behandlung und Veränderungen des Nährstoffgehalts (SI) verbunden sind. Die Behandlung von erg6Δ-Zellen mit 75 µg/ml Escin führte zu einer Hochregulierung von 199 Genen (Abb. 2c). Diese 199 DEGs sind mit Genen angereichert, die mit Reaktionen auf oxidativen Stress, chemischen Stress und Hunger (SI) verbunden sind.

Der Einfluss der Aescin-Behandlung auf die Gene des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels ist in Abb. S10 dargestellt. Als Reaktion auf 100 μg/ml Escin regulieren sowohl WT als auch erg6Δ Gene im Zusammenhang mit der Biosynthese von Trehalose, Glykogen und Glycerin stark hoch. Es wird angenommen, dass das Glukosepolymer Glykogen in erster Linie als Speicherkohlenhydrat fungiert, das nur geringe Auswirkungen auf den inneren osmotischen Druck der Zelle hat46,47. Es wird angenommen, dass dem Disaccharid Trehalose eine Schlüsselrolle beim Schutz der Struktur von Lipidmembranen und Proteinen zukommt, indem es Wasser aus Lipiddoppelschichten und Proteinoberflächen verdrängt und die Aggregation denaturierter Proteine ​​verhindert, was deren anschließende Rückfaltung verhindern würde47. Glycerin fungiert als wichtiger Osmolyt bei hyperosmotischem Stress und bildet das Rückgrat von Phospholipiden und Speicherlipid-Triacylglycerinen48. Die Hochregulierung der Trehalose-, Glykogen- und Glycerinbiosynthese ist Teil einer allgemeinen Reaktion auf Umweltveränderungen47,48,49. Darüber hinaus regulieren sowohl WT- als auch erg6Δ-Stämme Gene hoch, die für Proteine ​​des GID-Komplexes (Glucose Induced Degradation Deficient) kodieren, der die Gluconeogenese zugunsten der Glykolyse negativ reguliert, indem er die Polyubiquitinierung und den Abbau der Fructose-1,6-Bisphosphatase initiiert (Abb. S11). .

Als Reaktion auf 100 μg/ml Escin regulieren sowohl WT als auch erg6Δ auch Gene hoch, die für Enzyme des γ-Aminobuttersäure (GABA)-Shunt-Signalwegs kodieren (Abb. S12), der Glutamat über GABA abbaut. Bei Hefen hat sich gezeigt, dass dieser Weg wichtig für die Toleranz gegenüber Hitze und oxidativem Stress ist51.

Die hochregulierten DEGs sind auch mit Genen angereichert, die mit der Zellwandorganisation, einschließlich Sporulation und Chitinbiosynthese, zusammenhängen (Abb. S13). Durch die Wechselwirkung zwischen den Signalwegen der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) von High Osmolarity Glycerol 1 (Hog1) und Cell Wall Integrity (CWI) ist es schwierig, spezifische Belastungen zu erkennen, die die Hochregulierung dieser Gene auslösen, ohne defekte Mutanten zu verwenden in bestimmten Zweigen dieser Signalwege52,53,54.

Viele autophagiebezogene Gene werden in WT und erg6Δ als Reaktion auf die Aescin-Behandlung hochreguliert (Abb. S14), einschließlich Kernphagosomenkomponenten und Proteinen, die am Zytoplasma-zu-Vakuolen-Weg beteiligt sind, der selektiv Hydrolasen an die Vakuole abgibt55. Als Reaktion auf 100 μg/ml Escin werden im erg6Δ-Stamm mehr Autophagie-bezogene Gene um das ≥ 2-fache hochreguliert als im WT (11 vs. 7).

Der erg6Δ-Stamm reguliert auch mehr Gene als WT als Reaktion auf 100 μg/ml Escin herunter (159 vs. 50), und diese DEGs sind mit Genen angereichert, die sich auf die Biogenese und Translation von Ribosomen beziehen. Diese Prozesse erfordern erhebliche Mengen an Energie56, und ihre Herunterregulierung ist Teil einer allgemeinen Stressreaktion, bei der Ressourcen auf Stressresistenz und nicht auf Zellproliferation umgeleitet werden57,58.

Wenn Aescin Ergosterol aus Zellen absondert oder die Sterol-Erkennung durch Wechselwirkung mit Ergosterol oder einem Sterol-Sensor hemmt, können wir als Reaktion auf die Aescin-Behandlung mit einer Transkriptionsänderung in Sterol-Biosynthesegenen wie ERG2 und ERG11 rechnen. Diese Gene werden durch die Sterolsensoren und Transkriptionsaktivatoren Upc2 und Ecm22 als Reaktion auf den Ergosteringehalt reguliert59,60. Eine unterschiedliche Expression von Ergosterol-Biosynthesegenen wird nicht beobachtet (Abb. S6), obwohl es in jedem Stamm eine statistisch signifikante, aber geringe Hochregulierung von UPC2 gibt (1,3-, 1,9- und 1,5-faches für WT, erg6Δ bzw. erg3Δ). Eine kleine Anzahl von Genen, die mit der Sphingolipidversorgung zusammenhängen, werden als Reaktion auf Escin in WT und erg6Δ hochreguliert (Abb. S7), obwohl zu beachten ist, dass ein Großteil der Sphingolipidregulierung posttranslational erfolgt31.

Im Gegensatz zu den großen Transkriptomveränderungen, die bei den WT- und erg6Δ-Stämmen beobachtet wurden, reguliert der erg3Δ-Stamm als Reaktion auf 100 µg/ml Escin nur 19 Gene hoch und 4 herunter (Abb. S15). Die meisten dieser DEGs werden auch im WT- und/oder erg6Δ-Stamm als Reaktion auf die Aescin-Behandlung unterschiedlich exprimiert, mit Ausnahme von HAP4 (kodiert für einen Atmungsregulator), YOL163W (gilt als nicht funktionsfähig), YGL088W (unbekannte Funktion) und … Zellwand-Mannoprotein-Gene DAN1 und DAN4.

Um zu untersuchen, ob die Aescin-Reaktions-DEGs im WT-Stamm unter Kontrollbedingungen bereits unterschiedlich in erg3Δ exprimiert werden und Erg3Δ möglicherweise auf den Stress der Aescin-Behandlung „vorbereiten“, haben wir DEGs in den Vergleichen WT 100 mit 0 µg/ml Escin verglichen. und erg3Δ 0 µg/ml Escin im Vergleich zu WT 0 µg/ml Escin (Abb. S16a). Unter Kontrollbedingungen weist der erg3Δ-Stamm eine erhöhte Expression von 18 Genen auf, die im WT als Reaktion auf die Aescin-Behandlung ebenfalls hochreguliert werden, und eine geringere Expression von 5 Genen, die im WT als Reaktion auf die Aescin-Behandlung herunterreguliert werden. Eine Heatmap, die die Expressionsniveaus dieser überlappenden Gene zeigt, ist in Abb. S16b enthalten. Die meisten dieser Gene werden auch im erg6Δ-Stamm unter Kontrollbedingungen unterschiedlich reguliert, und der erg6Δ-Stamm weist nicht den Phänotyp der erhöhten Escin-Toleranz auf. Die Ausnahmen sind PAI3 (kodiert für einen zytoplasmatischen Proteinase-A-Inhibitor), SRL3 (kodiert für einen Zellzyklusregulator), HED1 (kodiert für ein Meiose-spezifisches Protein), MAL31 (kodiert für eine Maltosepermease), ARG3 (kodiert für Ornithincarbamoyltransferase), COS111 (kodiert ein mitochondriales Protein), die Gene YBR090C und YKR075C mit unbekannter Funktion sowie die Gene YJR037W und YJL195C, die wahrscheinlich keine funktionellen Proteine ​​kodieren.

Insgesamt zeigen diese Daten, dass Escin keinen Einfluss auf das Wachstum und einen vernachlässigbaren Einfluss auf das Transkriptom von erg3Δ-Zellen hat. Dies ist wahrscheinlich nicht darauf zurückzuführen, dass erg3Δ-Zellen bereits auf die durch die Aescin-Behandlung induzierten Belastungen vorbereitet sind, sondern ist möglicherweise auf die chemische Zusammensetzung ihrer Membransterole zurückzuführen.

Um die Hypothese zu untersuchen, dass Aescin durch direkte Wechselwirkung mit Ergosterol Toxizität vermittelt, nicht jedoch mit den in erg3Δ vorhandenen veränderten Sterinen, haben wir die Auswirkungen der Behandlung von WT-Zellen mit Aescin allein oder mit Aescin, das zuvor mit Ergosterol gemischt wurde, in einem 1 untersucht :1 Molverhältnis. Es wurde angenommen, dass, wenn Ergosterol direkt mit Aescin interagiert, eine Aescin-Ergosterol-Mischung aufgrund der geringeren Zugänglichkeit der Aescin-Saponine einen geringeren Einfluss auf das WT-Wachstum hätte als Aescin allein. Bemerkenswert ist, dass Hefezellen unter aeroben Bedingungen keine exogenen Sterole importieren37.

Das Experiment wurde unter Verwendung von Mikroplattenkulturen und CSM-Medien (Complete Supplement Mix) durchgeführt, im Gegensatz zu YPD, da der genaue Gehalt an CSM definiert ist, während YPD ein reichhaltiges Medium ist, das komplexe Moleküle aus Hefeextrakt enthält, die auch mit Aescin interagieren können und/oder Sterole. Frühere Studien haben gezeigt, dass Ergosta-7,22-dienol das vorherrschende Sterin in Hefen ist, denen Erg3 fehlt, wobei sich auch Episterol und Ergosta-7-enol anreichern31,43. Als der Sterolgehalt durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie überprüft wurde (Abb. S2 und S3), entsprach die relative Retentionszeit des größten Sterolpeaks im erg3Δ-Gesamtionenchromatogramm früheren Berichten für Ergosta-7,22-dienol, als der Stamm wurde entweder in YPD oder CSM gezüchtet.

Die MHK von Escin in CSM-Medien wurde für WT-Zellen mit 63 μg/ml bestimmt (Abb. 5b); 2,4-fach niedriger als bei YPD. Währenddessen war das Wachstum des erg3Δ-Stammes bis zur höchsten getesteten Konzentration (500 μg/ml) ungehemmt. Als Escin mit Ergosterol im Molverhältnis 1:1 vorgemischt und die Mischung den Zellen zugesetzt wurde, wurde das Wachstum des WT-Stammes in Gegenwart von 63 μg/ml Escin vollständig wiederhergestellt (Abb. 5c). Das Vormischen von Escin mit Ergosterol stellte auch den Prozentsatz der mit dem membranundurchlässigen Farbstoff Propidiumiodid gefärbten Zellen wieder her, um die Behandlungsmengen zu kontrollieren (Abb. S17), was auf eine verringerte Zellpermeabilität und/oder eine erhöhte Lebensfähigkeit der Zellen hinweist.

Wiederherstellung des Wachstums, wenn Aescin mit Ergosterol vorgemischt wird, jedoch nicht mit Brassicasterol. (a) Struktur von Ergosterol (dem vorherrschenden Sterol in der Plasmamembran von S. cerevisiae), Brassicasterol (einem pflanzlichen Sterol) und Sterolen, von denen festgestellt wurde, dass sie sich im erg3Δ-Stamm anreichern (Episterol, Ergosta-7,22-dienol, Ergosta- 7-Enol). (b) und (c), Wachstum in Mikrotiterplattenkulturen, angezeigt durch ΔA595 (0–24 h). Drei biologische Replikate ± Standardabweichung (SD). In (b) beträgt die MHK von Escin in CSM-Medien 63 μg/ml für WT, was 2,4-fach niedriger ist als in reichhaltigem Komplexmedium. In (c) wurden WT-Zellen in Gegenwart von 0 oder 63 μg/ml Escin (1,25 % Methanol) allein oder vorgemischt mit Ergosterol oder Brassicasterol im Molverhältnis 1:1 gezüchtet. Nur Ergosterol- und Brassicasterol-Kontrollen wurden einbezogen. Statistik: einfaktorielle ANOVA mit Post-hoc-Tukey-HSD-Test, Bedingungen, die nicht durch denselben Buchstaben verbunden sind, unterscheiden sich signifikant (p ≤ 0,05).

Die in erg3Δ vorhandenen Sterole sind nur begrenzt verfügbar, daher haben wir zum Vergleich auch das Wachstum beurteilt, wenn Escin mit dem Phytosterol Brassicasterol vorgemischt wurde, das ebenfalls eine Doppelbindung im B-Ring aufweist, obwohl sich diese zwischen C- und C-Ring befindet. 5 und C-6 (Abb. 5a). Im Gegensatz zu dem wiederhergestellten Wachstum, das beobachtet wurde, wenn Escin mit Ergosterol vorgemischt wurde, wurde keine Wiederherstellung des WT-Wachstums beobachtet, wenn Escin mit Brassicasterol im Molverhältnis 1:1 vorgemischt wurde (Abb. 5c).

Dies stützt die Hypothese, dass Aescin direkt mit Ergosterol interagiert und dass kleine Veränderungen in der Sterolstruktur einen großen Einfluss auf die Stärke der Sterol-Saponin-Wechselwirkungen haben können.

Saponine sind eine vielfältige Gruppe hochwertiger pflanzlicher Naturprodukte mit großem Potenzial in vielen Branchen. Eine kürzliche Zunahme der Identifizierung von Pflanzengenen, die an der Saponin-Biosynthese beteiligt sind, hat die Manipulation von Hefe für die Saponinproduktion ermöglicht.61 Allerdings ist bekannt, dass viele Saponine, einschließlich Escin, eine antimykotische Aktivität und/oder eine lytische Wirkung auf rote Blutkörperchen und synthetische Membranen haben9. 23,25,62,63. Daher ist es wahrscheinlich, dass einige Saponine das Hefewachstum hemmen, insbesondere in hohen Konzentrationen, was die Produktivität einschränken würde. Hier untersuchen wir die Wirkung der Saponinmischung Escin auf Hefezellen, da Escin starke therapeutische Eigenschaften hat4 und die Produktion spezifischer Escin-Saponine in Hefe eine kostengünstige Biosynthese und Reinigung bioaktiver Komponenten im industriellen Maßstab ermöglichen würde.

Wir berichten, dass die MHK von Escin gegenüber WT-Hefe 150 μg/ml in reichhaltigem, undefiniertem (YPD) Medium und 63 μg/ml in synthetisch definiertem (CSM) Medium beträgt. Zusätzlich zum reichhaltigeren YPD-Medium, das komplexe Vorläufer für viele Biosyntheseprozesse enthält, unterscheiden sich diese Medien im Kohlenstoffgehalt, der Pufferkapazität und der Osmolarität64. Diese Unterschiede tragen wahrscheinlich zu dem beobachteten Unterschied in der MHK bei.

Um die Hypothese zu untersuchen, dass Escin das Hefewachstum durch Wechselwirkung mit Ergosterol hemmt, haben wir den Einfluss von Escin auf das Wachstum von Mutanten in der Ergosterol-Biosynthese untersucht. Wir haben festgestellt, dass Escin einen vernachlässigbaren Einfluss auf das Wachstum der Sterol-C-5-Desaturase-Mutante erg3Δ hat. Es gab auch nur geringe Auswirkungen auf das Transkriptom von erg3Δ-Zellen als Reaktion auf die Aescin-Behandlung. Im Gegensatz dazu kommt es in WT- und erg6Δ-Zellen als Reaktion auf die Aescin-Behandlung zu großen Transkriptomveränderungen, und die hochregulierten Prozesse entsprechen denen, die als Reaktion auf osmotischen, oxidativen, Temperatur- und Hungerstress induziert werden. Aufgrund der Überschneidung zwischen Stresssignalwegen52,53,54 kann die spezifische anfängliche Störung, die die Transkriptomreaktion auslöst, nicht allein anhand der Transkriptomdaten bestimmt werden. Ein Vergleich zwischen Genen, die im WT-Stamm als Reaktion auf die Aescin-Behandlung unterschiedlich exprimiert werden, und Genen, die im erg3Δ-Stamm im Vergleich zum WT unter Kontrollbedingungen unterschiedlich exprimiert werden, zeigt, dass das erg3Δ-Transkriptom nicht auf den Stress von Aescin „vorbereitet“ ist Behandlung. Die Feststellung, dass das Vormischen von Escin mit Ergosterol im Molverhältnis 1:1 die wachstumshemmende Wirkung von Escin auf WT-Zellen lindert, stützt die Hypothese, dass die Toxizität von Escin gegenüber Hefen durch die direkte Wechselwirkung zwischen Escin-Saponinen und Ergosterol vermittelt wird.

Phänotypen der lebensfähigen Ergosterin-Biosynthesemutanten und ihre Relevanz für Hefezellfabriken wurden kürzlich überprüft29. Mutanten in der Ergosterol-Biosynthese sind normalerweise anfälliger für eine antimykotische Behandlung als WT-Zellen29. Dies wurde auf eine erhöhte Membranpermeabilität, Hyperpolarisierung der Plasmamembran und eine verringerte Aktivität von Effluxpumpen wie Pdr5p in den mutierten Zellen zurückgeführt, was zu einer erhöhten intrazellulären Akkumulation der Antimykotika führte29. Eine Ausnahme bildet die erhöhte Fluconazoltoleranz von Candida albicans-Stämmen, denen das C. albicans-Enzym Erg3 fehlt29. Fluconazol hemmt das Lanosterol-14-α-Demethylase-Enzym Erg11, was zur Akkumulation von 14α-Methylergosta8-24(28)dienol in Zellen mit funktionellem Erg3 und von 14α-Methylfecosterol in Zellen ohne Erg3-Aktivität führt. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass 14α-Methylergosta8-24(28)dienol schädlich für C. albicans-Zellen ist65.

Ergosterol-Biosynthese-Mutanten weisen außerdem in unterschiedlichem Maße eine erhöhte Toleranz gegenüber den Polyen-Antimykotika Nystatin und Amphotericin B29 auf. Nystatin bindet Ergosterol in synthetischen Liposomen und bildet bei hohen Konzentrationen Poren66, während Amphotericin B Ergosterol in Zelloberflächenaggregaten bindet67. Es ist plausibel, dass die in den Mutantenstämmen vorhandenen Sterole nicht so stark mit Nystatin und Amphotericin B interagieren wie Ergosterol. Darüber hinaus weisen erg6Δ-Zellen von S. cerevisiae eine erhöhte Toleranz gegenüber dem steroidalen Glykoalkaloid α-Tomatin auf, während erg3Δ-Zellen eine erhöhte Toleranz gegenüber Tomatidin (dem Aglykon von α-Tomatin) aufweisen68. Es wurde berichtet, dass das steroidale Glykoalkaloid α-Tomatin die Permeabilität synthetischer Vesikel durch Wechselwirkung mit Sterolen erhöht.69 Auch hier ist es plausibel, dass α-Tomatin und Tomatidin mit den in erg6Δ und erg3Δ vorhandenen Sterinen mit geringerer Affinität als Ergosterol interagieren.

Kürzlich wurde der Einfluss von Escin auf synthetische Modellmembranen mithilfe von Differentialscanningkalorimetrie, Weitwinkel-Röntgenstreuung, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und Kleinwinkel-Neutronenstreuung untersucht. Diese Studien weisen darauf hin, dass Escin die Steifigkeit von 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC)-Phospholipid-Doppelschichten unterhalb der DMPC-Schmelztemperatur erhöht und die Fließfähigkeit von DMPC-Doppelschichten oberhalb der DMPC-Schmelztemperatur erhöht17,62,63. Der membranerweichende Effekt ist wahrscheinlich auf Kopfgruppenwechselwirkungen zwischen der Glykosidkomponente von Escin und der Phosphocholinkomponente von DMPC zurückzuführen, während der Versteifungseffekt vermutlich auf den Einbau des starren Triterpenoidrückgrats von Escin-Saponinen in die Lipiddoppelschicht zurückzuführen ist17. Wenn Cholesterin in DMPC-Doppelschichten enthalten ist, bilden sich starke Komplexe zwischen Cholesterin und Escin-Saponinen, wodurch die Menge an freiem Escin, das für die Wechselwirkung mit der Phospholipidmembran zur Verfügung steht, verringert wird und es zu einer Verformung kleiner unilamellärer Vesikel kommt25. Es ist plausibel, dass Escin-Saponine auch mit Ergosterol interagieren und in ähnlicher Weise die Dynamik und Organisation der Plasmamembran beeinflussen. Dies kann zur Porenbildung führen, die Stabilität der Plasmamembran stören und/oder die laterale Organisation und Aktivität von Plasmamembranlipiden und -proteinen beeinträchtigen.

Die Feststellung, dass das Vormischen von Escin mit Ergosterol die hemmende Wirkung von Escin lindert, während das Vormischen mit Brassicasterol dies nicht tut, und dass erg3Δ-Mutanten eine erhöhte Toleranz gegenüber der Behandlung mit Escin aufweisen, während dies bei erg2Δ, erg4Δ, erg5Δ und erg6Δ nicht der Fall ist, unterstreicht diesen geringen Wert Veränderungen in der Sterol- und vermutlich Saponinstruktur können einen großen Einfluss auf die Saponinbioaktivität haben. Die Störung des C-5-Desaturase-Gens ERG3 ist eine vielversprechende technische Strategie für die Produktion von Escin-Saponinen in manipulierter Hefe. Stämme mit unterschiedlichen Lipidomen können eine erhöhte Toleranz gegenüber anderen Saponinstrukturen aufweisen, und insgesamt zeigt diese Forschung, dass das Screening der Produkttoleranz von Lipidommutanten eine entscheidende Voraussetzung für die Entwicklung von Hefestämmen für die Saponinproduktion sein sollte.

In dieser Studie wurden Saccharomyces cerevisiae BY4741 als Wildtyp-Hintergrundstamm und Deletionsmutanten aus der Yeast Deletion Collection30 verwendet. YPD-Medien; 10 g/L Hefeextrakt, 20 g/L Pepton, 20 g/L Glucose. CSM-Medien; 6,7 g/L Hefestickstoffbasis (Sigma Y0626), 790 mg/L komplette Ergänzungsmischung (Formedium DCS001), 20 g/L Glucose.

Zellen aus Übernachtkulturen wurden in sterilem Wasser gewaschen und in 100 µL Kulturvolumina in 96-Well-Platten (Thermo Scientific Nr. 167008) mit einer anfänglichen OD600 von 0,2 (entspricht A595 0,04 im Plattenlesegerät) inokuliert. Die Platten wurden in Tecan Sunrise-Plattenlesegeräten bei 30 °C und „normalem“ Schütteln inkubiert. Zur Beurteilung des Wachstums wurde A595 erfasst, das mit der Zelldichte korreliert.

Hefestämme wurden in YPD- oder CSM-Medien mit einer OD600 von 0,25 inokuliert und 24 Stunden lang (30 °C, 200 U/min) inkubiert. Die Zelldichte jeder Kultur wurde dann auf OD600 2,7 eingestellt und etwa 36,9 × 106 Zellen (aus 1,5 ml Kultur) wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 500 µL Lysepuffer (20 % KOH, 50 % Ethanol, 80 nM Coprostanol) lysiert ) für 10 Min. (100 °C). Sterole wurden dreimal in 500 µL Hexan extrahiert. Die organischen Phasen wurden gepoolt und 1 ml mit einem GeneVac EZ-2 Elite-Verdampfer zur Trockne eingedampft. Die Proben wurden mit 50 µL Pyridin:N-Methylsilyltrifluoracetamin (1:4) direkt vor der gaschromatographischen Flugzeit-Massenspektrometrie (GC/QTOF-MS) trimethylsilyliert. Vollständige GC/QTOF-MS-Details sind in SI enthalten.

Übernachtkulturen in YPD-Medien wurden verwendet, um 20 ml YPD in 100-ml-Erlenmeyerkolben bei OD600 0,1 anzuimpfen. Die Kulturen wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet (30 °C, 200 U/min Schütteln) und dann 60 Minuten lang mit 0, 75 oder 100 µg/ml Escin in Wasser behandelt. Zellpelletproben von etwa 2 × 107 Zellen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und vor der RNA-Extraktion bei –80 °C gelagert. Informationen zu Methoden zur RNA-Extraktion, Sequenzierung und Datenanalyse finden Sie in den Zusatzinformationen. Die RNA-Sequenzierung wurde am Centre for Genomic Research der University of Liverpool durchgeführt.

Zur Herstellung von Kammerobjektträgern (Ibidi 80807) wurden 100 μl 2 mg/ml Concanavalin A (Sigma C2010) in jede Vertiefung pipettiert, 30 s lang inkubiert und abgesaugt. Anschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit Wasser gewaschen. Hefe wurde in CSM-Medium bis zu einer OD600 von 0,4 gezüchtet und 400 μl in jede Vertiefung überführt. Nach 5 Minuten wurde die Kultur abgesaugt, die Vertiefungen dreimal mit Behandlungsmedium (400 μl PBS 1,25 % Methanol, unterschiedliche Aescin-Konzentrationen) gewaschen und 1 Stunde lang inkubiert (30 °C, 200 U/min, dunkel). Die Zellen wurden dann dreimal mit 400 μl PBS mit 5 μg/ml PI (Invitrogen P3566) gewaschen, 20 Minuten lang inkubiert (30 °C, 200 U/min, dunkel), dreimal mit 400 μl PBS gewaschen und auf einem Leica DMi8 abgebildet inverses Mikroskop (540-580/592-668 ex/em).

Ergänzende Abbildungen, Methoden und Details zu den Ergebnissen der differenziell exprimierten Gene und der Genset-Anreicherung sind in den ergänzenden Dateien enthalten. RNA-Sequenzierungsdaten sind im European Nucleotide Archive verfügbar (Projektzugangsnummer PRJEB61952).

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Industrial Biotechnology Innovation Center (IBioIC Project-2016-150) und des Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC Project BB/S017712/1 und IBCatalyst Project No. 102297) sowie eines BBSRC IBioIC Industrial finanziert CASE CSV-Stipendium bei Unilever. Die RNA-Sequenzierung wurde am Centre for Genomic Research der University of Liverpool durchgeführt. Die Autoren danken Dr. Marcus Price (University of Edinburgh) und Prof. Klaus Suhling (King's College London) für Kommentare zum Manuskript.

Zentrum für Ingenieurbiologie, Universität Edinburgh, Edinburgh, EH9 3BD, Großbritannien

Emily J. Johnston, Jess Tallis und Susan J. Rosser

Abteilung für Infektionsbiologie und Mikrobiome, Institut für Infektions-, Veterinär- und Ökologiewissenschaften, Universität Liverpool, Liverpool, L69 7ZB, Großbritannien

Edward Cunningham-Oakes

EdinOmics, RRID:SCR_021838, University of Edinburgh, Max Born Crescent, Edinburgh, EH9 3BF, Großbritannien

Tessa Moses

Abteilung für Genetische Wissenschaft, Thermo Fisher Scientific, 7 Kingsland Grange, Warrington, Cheshire, WA1 4SR, Großbritannien

Simon J. Moore

Unilever R&D Port Sunlight, Quarry Road East, Bebington, Wirral, CH63 3JW, Großbritannien

Sarah Hosking

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EJJ: Konzeptualisierung, Untersuchung, Dateninterpretation, Manuskripterstellung. JT: Untersuchung, Dateninterpretation. ECO: Dateninterpretation. TM: Untersuchung, Dateninterpretation, Überwachung. SM: Untersuchung, Dateninterpretation. SH: Konzeptualisierung, Dateninterpretation, Supervision. SJR: Konzeptualisierung, Dateninterpretation, Supervision.

Korrespondenz mit Emily J. Johnston oder Susan J. Rosser.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Johnston, EJ, Tallis, J., Cunningham-Oakes, E. et al. Hefen, denen die Sterol-C-5-Desaturase Erg3 fehlt, sind tolerant gegenüber dem entzündungshemmenden Triterpenoid Saponin Escin. Sci Rep 13, 13617 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40308-0

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Eingegangen: 10. Mai 2023

Angenommen: 08. August 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40308-0

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